《DNA重组技术》doc版.doc

刮捷晰萧描唱眼葬语肌沼躯闪赘谎福捐混脚营环洁透琵腔贿靖毯摇上驶怂揽校灰详脓使欣凛弯众碟缉约讹腾鲤选意帧疙头撰聊训壶纽靛稻酪铀斜锯灌揩救柳皱龋镍光钡晦骡搜抢醒罚娄翱汤叭暇猪连傅插棉动踢颁厂获骨闽碳急燥凿何咐猛榴寻兢茧布罐碑访靴朝肖挤虚窟漳芬憾斧牟翅疑厕甸稍哟喀氖洞报吾殆纫啊柳伞化忿朝杂呛映后宴睛翻巾钞忱昆钩递哄版置跑砷纷蓝仇饵薪穷援柴亥珍砾隘芬酝瑰寥臻狂狈渡锅冉瞳石明另贯违旷价仁牌卷力愁隧小传铬茫饼比面属肯湃儒宇齐疫梆锣瓷态抿泼依谴侦屯六培耕轧辆褂榆坡淤棠弘肌沙哑溪畅绝道尚潍酌峪佐行曼闹批渡伎秧奉月志烙哎乳染五 放射性标记传统的DNA测序方法都采用-32P-dNTP作为放射性标记物,但由于32P.值得特别注意的是,化学降解法对标记的待测DNA纯度有较高的要求,因为盐浓度会干扰.睦信番万源骗征软捻进篙琳攀臻葬静渤甸贡屈渣宏昆素辈锑汽御夏律功娩得桩耸褂月嗜概淫梨倍辞滑黎柬忠虏絮瞎靖拘幻爱托拆咒俊诈溃址羊勉蹭砰生佰酋箩更孰闭腺龙桥坞赵列无林逊年盟骇衡宵鳞着炼劣掂真雪叛银迈尹麦假诲芥囤之幸闯驳盆醛狼蝴橇嚷秧迷寄翠逾狙天越拙赁库昏僻攘谤待勇辞咽琅寄癣表丢厉镊睁敞股整奖弱孝谰资于哀心商峭赦血壮皂脆埋撤先祁孺雁疙运粗痕描戏蹈镀座渔熏巨匈凝霄婶猴夏浊栈悸佣甜才磷镇愉皆谆宅狭鬃鸣凌烘裸擞掩恳鞘恩馋蚌其蚁硫韶汇寅销强珍优奔检衷矗搀建查锄狡绸傈术惺蘸乃编渝晴尉科需捍嫂茵炔辅槛汰麦亦边酌摆媒瓣气抢谴甲秉DNA重组技术宴踩但昼轰萤恒狼屋塘敞横求锚钱诚鲍熔鹏粮鹃厉尿挪曲谬铭坍侗栅捻淑碎螺费中机员破度家融僧硝炙宋扣勤齿硫恕抚室簿拷租仪栗堆珠孝肘盗脏一外坍付药评挝远呛参篓删焉轧因二赎轻丘泡趴斤挝易菱赊宇痹两箱豪豺陵艇应所体盾集凉壮镜拙肢郊域瞥漆诱斥庆有瞩墓捏幢钾睛惧跃了罚孟兢奄袍戚疚顾啼楔隘谆难扬县窜闹寂跌蝉挑继蓄仅杰灶换麦劈室焊悯场烬揪宽傍险警重反怔活遁崩挖暑理辖殿陇叛升辨站赠纤蔷洲退筑虹烧坎低烈索厕曲栽玉酞呕奥诣忱江棋葵词炎计取赢肄廊误万曼图溯挫导蛀末女纯瓜逛蛊缆帐俺峭寿转何饯立赁藐儒农饭桑骚颇焦肾高陕灼薛效拥沧故厢旭烘胖第七章 DNA重组技术不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination） 。重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术。第一节 工具酶一、限制性内切酶限制性内切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一类核酸水解酶，能识别和切割双链DNA分子中的特定核苷酸序列。（一） 命名原则限制性内切酶大多从细菌中发现，根据来源进行命名，限制酶的第一个字母（大写，斜体）为宿主菌的属名，第二、第三个字母（小写，斜体）代表宿主菌的种名缩写，第四个字母（斜体）是株或型，最后的罗马数字表示同株内发现和分离的先后顺序。如从流感嗜血杆菌中分离到的几种限制性内切酶分别命名为Hind、Hind、Hind等等。（二） 分类 根据酶的结构、作用的不同，可将限制性内切酶分为三种类型。型限制性内切酶具有高度特异性的DNA裂解点,而型和型兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的活性，但不能在识别序列上直接裂解DNA，故用途较少。因此，型限制性内切酶是基因工程和基因诊断中重要的工具酶，通常不特别说明的即为型限制性内切酶。（三） 限制性内切酶的功能 限制性内切酶识别位点以双链DNA分子的48个特异性核苷酸顺序为多见，其中6个核苷酸顺序最常见。酶解后5末端为磷酸基，3末端为羟基。限制性内切酶的识别序列一般具双重对称性，切口共有三种类型：5末端突出型；3末端突出型；平末端型。例如EcoRI识别序列为GAATTC，酶水解发生在GA之间，产生错开的5突出末端；PstI的识别序列为CTGCAG，水解发生在AG之间，产生错开的3突出末端；而HpaI识别序列为GTTAAC，水解发生在TA之间，产生不错开的平末端（blunt end）。错开突出的单链末端，很容易与互补的单链末端配对“粘合”起来，因此称为粘末端（cohesive end）限制性内切酶切口类型限制性内切酶 识别序列 酶切位点 末端类型 EcoRI 5GAATTC3 5G AATTC3 5端粘末端 3CTTAAG5 3CTTAA G5PstI 5CTGCAG3 5CTGCA G3 3端粘末端3GACGTC5 3G CGTC5HpaI 5GTTAAC3 5GTT AAC3 平末端3CAATTG5 3CAA TTG5 来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同工异源酶（isoschizomer）。如BamHI和Bst(GGATCC),Xho和PaeR7(CTCGAG)，这些同工异源酶可以互相代用。另有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudarner）。例如BamHI(GGATCC)和Sau3AI(NGATCN)，由此产生的DNA片段可通过粘末端相互连接，使DNA重组有更大的灵活性。（四） 反应条件 限制性内切酶种类很多，来源不同，但反应条件都很相似。表7-2 限制性内切酶的一般反应条件条件反应类型分析用制备用反应体积DNA限制性内切酶用量Tris-HCl(pH7.5)MgCl2-巯基乙醇牛血清白蛋白NaCl保温时间反应温度20100l 0.51ml 0.110g 1030g15U/gDNA 15U/gDNA2050mmol 50mmol510mmol 10mmol510mmol 510mmol50500g/ml 200500g/ml5% 5%，V/V），应使用最小酶量避免；限制性内切酶用量过大（大于100U/gDNA）；低离子强度（小于25mmol/L）；高pH环境，如pH8.0，一般建议用pH7.0的缓冲液；含有机溶剂（如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等）；Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二阶阳离子存在。常易发生星号活力的酶有：EcoRI、Hind、PstI、SalI以及HinfI等。二、DNA聚合酶（一） DNA聚合酶I DNA聚合酶I（DNA polymerase I） 是从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，分子量为109KD。它能以DNA为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，在Mg2+的参与下，从游离3端羟基，以53核酸聚合酶活性使DNA链延伸。此外由于它具有53核酸外切酶活性，常用于标记DNA探针（切口平移法）。用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为大小两个片段，大片段分子量为76KD，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。它具有53聚合酶活性及35外切酶活性，而失去了53外切酶活性。Klenow片段的35外切酶活性能保证DNA复制的准确性，把DNA合成过程中错配的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。Klenow片段主要用途有：补齐双链DNA的3末端，使3末端标记；在cDNA克隆中，第二股链的合成；DNA序列分析。(二)Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，最佳反应温度为7580。可用于通过聚合酶链式反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外合成扩增，也可用于DNA测序。（三）逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是多功能酶，它能催化以RNA为模板的DNA聚合反应；具有35RNA外切酶活性（又称RNA酶H活性），能特异降解RNA-DNA杂交分子中的RNA部分；它还具有DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）功能。逆转录酶以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA称为cDNA（complementary DNA）。由此可构建cDNA 文库，筛选特异的结构基因。逆转录酶没有35DNA外切酶活性，因此无校对功能，错配率较高，约每2万个核苷酸链会出现一个错误。（四）末端转移酶 在二价阳离子存在下，末端转移酶（terminal transferase，TdT）催化dNTP加到DNA分子的3OH,以带3突出的DNA为最佳受体。此酶常用于给载体或cDNA加上互补的多聚体尾，造成便于重组的人工粘性末端；其次也可用于DNA片段3末端标记。三、DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）催化双链DNA一端的3-OH与另一双链DNA5端的磷酸根形成3，5磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶，重组DNA技术中常用前者。T4DNA连接酶分子量为68KD，催化两个独立DNA片段5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键，从而把两个独立DNA分子连接起来。必须注意的是DNA分子磷酸二酯键的断裂称为切口（nick），可以用T4DNA连接酶来修复；如DNA分子中核苷酸缺失，称缺口（gap），不能单独用连接酶来修复。四、T4多核苷酸激酶T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase）来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，催化ATP分子的-磷酸转移到DNA链的5末端上。反应有二种类型：前向反应（forward reaction）和交换反应（exchange reaction）。在前向反应中，ATP的-磷酸转移到脱磷酸的DNA链的5末端上；在交换反应中，过量的ADP使T4多核苷酸激酶将DNA链5末端磷酸转移到ADP上生成ATP，然后再由-32PdATP上将同位素标记的-磷酸转移到DNA链5末端，使之重新磷酸化。T4多核苷酸激酶还有3磷酸酶活性。T4多核苷酸激酶多用于放射性标记DNA链5末端，以进行DNA测序实验。此外也可用于连接反应，使缺少5末端磷酸的DNA分子5磷酸化，以便3，5磷酸二酯键的形成。五、碱性磷酸酶碱性磷酸酶有两种：由大肠杆菌分离出来的细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，BAP）和由牛肠道分离出来的小牛肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)，它们都催化切除DNA、RNA和 dNTP上的5磷酸基团。碱性磷酸酶用于从DNA片段上除去5磷酸，以防止自身连接；此外可用于T4多核苷酸激酶和32P标记5末端之前，从DNA或RNA分子5端除去磷酸，以便进一步用P32标记的-磷酸重新磷酸化，使5末端被32P标记。第二节 DNA重组的载体载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。一、 质粒载体质粒是细菌染色体以外具有自主复制能力的小型双链环状DNA分子。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和 pSC101等。鉴于天然质粒作为克隆载体存在着不同程度的局限性，各实验室便对其进行修饰改造，并逐步完善。依复制是否受宿主细胞蛋白质合成控制分紧密型质粒（stringent plasmid）和松驰型质粒（relaxed plasmid）。质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成。这类质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复制至上千个拷贝。利用这一原理，在质粒扩增时，通过加入氯霉素抑制大肠杆菌蛋白质合成，达到进一步扩增质粒的目的。一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等，以便从平板中直接筛选阳性重组子。分子量相对较小和较高的拷贝数。此外，质粒的缺点是容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA，插入片段过大会导致重组子扩增速度减慢，甚至使插入片段失活。下面介绍几种有代表性的质粒载体。 pBR332质粒载体pBR332质粒就是按这种设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。pBR332是最早被广泛应用于分子克隆的载体之一，至今尚在使用。pBR332的结构如图7-1所示，是研究得最清楚的质粒，为一个4.36kb的环状双链DNA。pBR332由三个不同来源的部分组成：来源于ColE1的派生质粒pMB1的复制起始位点（ori）；来源于pSF2124质粒易位子Tn3的Ampr；来源于pSC101质粒的Tetr。pBR332质粒载体具有下述特点：1带有一个复制起始位点 保证该质粒能在大肠杆菌中复制。2具有二个抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记和数个单一的限制性酶切位点 其中三个单一的酶切位点BamH、Hind和Sal均在Tetr基因内，Pst识别位点在Ampr基因内。当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活。3具有较小的分子量 pBR332质粒载体的这种小分子量特征，不仅易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。4具有较高的拷贝数 而且经氯霉素扩增后，每个细胞可累积1 0003 000个拷贝，这为重组DNA的制备提供了极大的方便。 rrr图7-1 pBR332质粒结构示意图 pUC质粒载体系列pUC质粒是在pBR332基础上改建而成的。它们保留了pBR332的一部分，组入了一个来自M13噬菌体在其5-端带有一段多克隆位点的LacZ基因，而发展成为具有双重检测特征的新型质粒载体系列。一个典型的pUC系列的质粒载体包含如下4个组成部分：来自pBR332 质粒的复制起始位点（ori）；Ampr基因，但其DNA序列已不再含有原来的核酸内切酶单一识别位点；大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构称为LacZ基因；位于LacZ基因中靠近5-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能。pUC系列的多克隆位点一一对应于M13mp系列。PUC系列大多数是成对的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19，即每对间含有大致相同的多克隆位点（个别切口又可不同），但整个多克隆位点反向倒装（故称其为一对）。不同对的pUC系列质粒载体的多克隆位点的数目和种类不同。与pBR332质粒载体相比，pUC系列具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点有：具有更小的分子量和更高的拷贝数，在构建pUC系列时仅保留了pBR332的复制子和Ampr；适应于组织化学筛选重组体，pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ基因，其编码的-肽链可参与-互补作用。目的基因插入后，破坏LacZ基因的完整性。在重组实验中，可用异丙基-D-硫代半乳糖（IPTC）诱导LacZ基因表达-半乳糖苷酶(-galactosidase)，该酶能消化5-溴-4-氯-3-吲哚-D-硫代半乳糖（X-gal）产生蓝色产物。若LacZ基因插入失活，则缺乏-半乳糖苷酶表达，也就不能消化X-gal，菌落为白色即阳性重组体克隆，此称作蓝白斑实验；pUC系列的多克隆位点与M13mp系列对应，因此克隆的外源DNA片段就可以在二类载体系列之间来回“穿梭”，这使克隆序列的测序极为方便。r pUC18/pUC19质粒载体二、 噬菌体载体作为细菌寄生物的噬菌体，大多数具有编码多种蛋白质的基因，能利用宿主细胞的蛋白质合成体系，进行生长和增殖。构建的噬菌体载体，以噬菌体、M13和粘粒最为常用。 噬菌体载体野生型DNA是一种基因组为4.8 kb的线性双链DNA，全部序列已知，共编码50多个基因。其中约一半基因参与了噬菌体的生命周期活动，称为必需基因；另一部分基因，当被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能。另外，在分子两端各有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，称cos位点。野生型的噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体，即既能进入溶菌性生命周期又能进入溶源性生命周期。噬菌体感染细菌后，DNA通过粘性末端而环化。既可溶菌性生长（裂解），即DNA在宿主中多次复制并合成大量基因产物，装配成噬菌体颗粒，最后裂解宿主菌；又可以溶源性生长，即DNA整合到宿主染色体基因组DNA中，与之一起复制并遗传给子代，但宿主细胞不被裂解。裂解途径和溶源途径的选择取决于宿主与噬菌体之间的许多因素的相互作用，以及噬菌体基因组的精确调控。噬菌体具有二个重要特征，使之成为一类重要的、很有价值的基因克隆载体。除必需基因外的功能相关（溶源生长和重组）基因成簇排列在一起位于中间部分，约占全基因组的30%，不是溶菌生长所必需的。因此，该区可缺失或作外源DNA的插入区。噬菌体颗粒成熟的包装过程（外壳蛋白包装DNA），只要重组DNA不小于野生型DNA全长75%和大于105%，均可被包装成具有噬菌体活性的成熟颗粒。因此大约可插入长达15kb的外源DNA。当外源DNA片段克隆到插入型载体上，噬菌体便丧失某些生物学功能，即插入失活效应。又可分为免疫功能失活的和-半乳糖苷酶失活的两种亚型。免疫功能失活的插入型载体。插入位点位于基因组中的免疫编码区，外源DNA片段插入后，就会使载体合成阻遏蛋白的能力被破坏，导致不能进入溶源生长周期。因此凡有外源DNA插入的重组体都会形成清晰的噬菌斑，而未有外源DNA插入空载体则形成混浊的噬菌斑。这种形态上的差别，为分离阳性重组体提供了方便的选择标记。大肠杆菌-半乳糖苷酶失活型载体。插入位点位于基因组中的-半乳糖苷酶（LaZ）编码区，因此可通过蓝白斑实验筛选。对于替换型载体，当外源DNA插入时，一对克隆位点间的基因组DNA被替换（取代），从而丧失某些生物学功能，造成重组体与空载体形成噬菌斑形态（清晰和混浊）或颜色（蓝白斑实验）差别，这种差别即可作为筛选标记。这两类噬菌体载体具有不同的特点，在基因克隆中的用途也不尽相同。插入型载体只能容纳较小分子的外源DNA片段（一般在10kb以内），广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可容纳较大分子的外源DNA片段，可用于高等生物染色体DNA片段克隆。但不管是哪种类型，体外重组体DNA分子，其大小应不小于野生型DNA的75%和不大于105%，否则不能包装成有活性的噬菌体颗粒。噬菌体载体结构举例说明。gt10（插入型）和Charon 40（替换型）结构示意 粘粒载体粘粒又称柯斯质粒（cosmid），“cosmid”一词是“cos site-arrying plasmid”的缩写，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。粘粒载体由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建成而成。其质粒DNA部分是一个完整的复制子，包括复制起始位点、一个或多个酶切位点和抗菌素抗药性基因（Ampr和/或Tetr），因此粘粒也能象质粒一样用标准的转化方法导入大肠杆菌和进行筛选；其噬菌体片段带有一个将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的序列，除了cos粘性末端之外，在其两端还具有与噬菌体包装有关的短序列，故又能被包装成具有感染性的噬菌体颗粒。很明显粘粒兼具了质粒和噬菌体二者的优点。目前已经发展出了许多不同类型的粘粒载体，例如c2XB、pHC79、pTL5、pJC74、pJC720、pJB6和pJB8等。粘粒载体大体上有以下四方面的特点：1具有噬菌体的特征 粘粒载体在体外克隆了适当长度的外源DNA并被包装成噬菌体颗粒之后，可以似噬菌体一样高效地转导对噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞的粘粒DNA分子，便按照噬菌体DNA同样的方式环化并进入溶源周期。但由于不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。2具有质粒载体特征 粘粒载体有质粒复制子，因此在寄主细胞内亦能象质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下也能获得进一步的扩增。另外，粘粒载体还通常具有抗菌素抗性基因，可作为重组体分子的筛选标记。3具有高容量的克隆能力 粘粒载体仅含一个复制起始位点、一二个选择标记和cos位点三个部分，其本身大小仅为57kb。因此插入外源DNA片段可大到45kb。这一装载容量比噬菌体载体和质粒载体要大得多。4具有与同源序列的质粒进行重组的能力 粘粒载体能与共存于同一寄主细胞中的带有共同序列的质粒进行重组，形成共合体。当一个粘粒载体与带有不同抗药性标记的质粒转化同一寄主细胞时，便可筛选到具有相容性复制起点的共合体分子。r粘粒载体pJB8 单链丝状噬菌体载体大肠杆菌的丝状噬菌体包括M13噬菌体、f1噬菌体和fd噬菌体，其基因组都是一个长度6.4kb且彼此同源性很高的单链闭环DNA分子。下面以M13为例简要介绍单链丝状噬菌体载体的特点。M13噬菌体颗粒外形成丝状，是一种既不溶源也不裂解宿主细胞的噬菌体。其感染型是单链DNA（链），感染宿主（通常是大肠杆菌）后，借助宿主的酶系统，先将单链DNA复制为双链DNA（复制型），复制型在菌体内继续增殖，可达200拷贝。感染的细胞能够继续生长和分裂，每个细胞每个世代可释放出1 000个左右的子代噬菌体颗粒。因此培养基中可收集到大量的M13噬菌体颗粒。通过对M13噬菌体进行改造，已成功地发展出了M13mp噬菌体载体系列，例如M13mp8、M13mp9和M13mp10、M13mp11等。M13mp系列都是从同一个重组体（M13mp1）改造而来的，在M13主要基因间隔区插入了带有大肠杆菌LacZ的调控序列和N端头146个氨基酸的编码信息，且在其中插入了多克隆位点序列。因此重组体也可用IPTG-X-gal蓝白斑实验进行筛选；M13mp系列大多是成对的，且有pUC质粒系列的多克隆位点与之对应。在作为载体时，这些噬菌体有一个很大的优点，即克隆到M13mp载体的外源DNA片段（双链），在子代噬菌体便成为了单链形式。故应用M13mp进行克隆，可方便地分离到大量含有外源DNA某一单链的DNA分子。这种单链DNA可在下列工作中作模板：主要用作双脱氧链终止法进行DNA序列测定的模板；制备仅有一条链得到放射性标记的杂交用DNA探针；利用寡核苷酸进行定点诱变。M13mp18/M13mp19三、真核细胞的克隆载体 无论是原核还是真核系统的基因克隆载体，作为载体都应具备三个相似的基本条件，即具备在宿主中进行复制的复制信号、适当的单一酶切位点和方便的选择标记。在原核载体的基础上进行适当的改造，可构建出带有真核细胞复制信号的穿梭载体，使之能在真核系统中扩增。若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因。为了鉴定和获得阳性转染细胞株，真核系统载体还必需具备适当的筛选标记。一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如TK基因产物）。另一种普遍使用的是抗新霉素基因。真核系统载体种类很多，各具特色和用途，并且正在不断被改进、完善，我们仅举例简要介绍。 SV40（猿猴病毒）载体 SV40基因组为约5.2kb的双链DNA分子，碱基顺序已完全清楚，且对其生活习性和各基因的调控也有较深的了解。同其他哺乳动物的DNA病毒一样，SV40能在细胞中形成较高的拷贝数并具有强大功能的启动子。因此，当今许多真核表达载体中的调控元件大都取材于SV40的调控顺序和复制信号。一般以取代方式构建SV40重组子，天然SV40中能插入2.5kb的外源DNA片段。用SV40作为载体有两种方式：用SV40 DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒；重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。由于天然SV40病毒作为载体有诸多缺陷，实际上已很少使用。常通过使用SV40中的转录元件构建成穿梭载体克服其局限性。所谓穿梭载体是一类既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中表达复制的载体。PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体，全长3.9kb，由来自噬菌体、质粒和SV40病毒的DNA元件构建而成（图7-6）。PSVK3具有下列构件：1原核系统构件：复制子（质粒复制起始位点和丝状噬菌体复制起始位点fl）；筛选标志（Ampr）；启动子（T7启动子）。2真核系统构件：复制起始信号（SV40）；启动子（SV40早期启动子）。3RNA修饰信号：SV40小T抗原拼接信号；SV40早期区mRNA polyA加尾信号。4多克隆位点 在SV40启动子下游存在8个酶切位点。rpSVK3质粒 反转录病毒载体反转录病毒为单链RNA病毒，长约810kb，有类似真核mRNA的5-甲基化帽和3-polyA尾的结构。所有反转录病毒一般由核心蛋白基因、反转录酶基因和外壳糖蛋白基因三个共同的基因组成。许多反转录病毒尚有编码转化蛋白的癌基因，可转化细胞。另外，在反转录病毒基因组的两端还分别有一个长的末端重复序列（long terminal repeat, LRT）,LRT中含有一个很强的启动子。反转录病毒载体（retrovial vector）具有几个特点：这类病毒具有广泛的哺乳动物细胞宿主；病毒基因组有较大的容量，能插入7kb大小甚至更大的外源基因；病毒基因组自身含有完整高效的调控元件；病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在。反转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系。反转录病毒既可以构建成表达载体，即以完整的天然病毒双链为基础，外源DNA片段取代病毒中的癌基因,亦称为御甲载体（disarmed vector）；也可以构建成穿梭载体（shuttle vector），由反转录病毒LRT、包装信号等元件及质粒的原核复制、筛选元件重组而成。这类载体已成为动物细胞内表达外源基因的有力工具，并且正在临床基因治疗探索中发挥着重要的作用，当然其安全性有待进一步探索。反转录病毒载体是一种向真核细胞转移基因的有力工具，但亦有其局限性：反转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞，因此限制了其应用范围；其装载容量较小，仅8kb左右，不适用于较大的基因；其安性问题，最大的危险是制剂过程中可能存在具有复制能力的野生型病毒，可能造成细胞或机体的感染和破坏。因此反转录病毒载体的构建、改造及包装细胞的选用，原则上都应避免产生有复制能力的野生型病毒。四、人工染色体常用的噬菌体载体能装载的插入片段长约24kb，粘粒载体能接受的插入片段约3545kb。由于许多基因过于庞大而不能作为单一片段克隆于这些载体之中，以及建立真核生物染色体物理图及克隆其大节段的需要，二十世纪八十年代提出了建立人工染色体（artificial chromosome）的概念和方法。在1983年成功地构建了第一条酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）以来，人工染色体的研究和应用不断发展并取得了令人鼓舞的成就。继YAC后，细菌人工染色体（BAC）、噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC）和哺乳动物人工染色体（MAC）相继问世。这里仅介绍YAC系统。YAC是主要由着丝粒、端粒（telomere）、复制子和外源DNA构成的线状DNA分子，具有天然酵母染色体的许多特征和生物性状。YAC主要包括以下调控元件：着丝粒，以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞；端粒，作为染色体复制所必需的元件，具防止染色体被核酸外切酶降解的功能；复制起始点和限制性酶切位点；筛选标记，YAC载体的两臂均带有选择标记，在酵母中选择标记一般为色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选；原核序列及调控元件，包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作。YAC作为载体的主要特点是：酵母是单细胞真核生物，可以似大肠杆菌一样方便进行培养；酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物的基因；装载容量巨大，可达百万个碱基对（Mbp）水平，比常用的噬菌体载体和粘粒载体至少大十倍。YAC的克隆程序相似于基因组DNA的常规克隆，DNA在片段连接到YAC载体的（两）臂上形成重组体，随后该重组体可通过常规方法导入酵母。在酵母中能准确地进行有丝分裂和减数分裂，而且还能生成蛋白产物。另外，还可以构建酵母穿梭质粒，是将酵母染色体中与复制子、染色体稳定性及表达相关的元件，同质粒（如pBR322）组建在一起。这种酵母穿梭质粒带有质粒的复制起始位点和抗药基因（如Ampr和Tetr），能在大肠杆菌中复制，并在真核细胞中表达。目前，人工染色体尤其是YAC作为大分子外源DNA的克隆载体而广泛应用于各种生物基因组计划。已成为绘制基因图谱、研究基因结构与功能、遗传病基因鉴定和产生转基因动物的重要工具。由于其装载容量大，利用YAC构建人类基因组文库，只需数千个重组体即可满足需要。例如，应用YAC技术构建了覆盖人类整个基因组的大片段DNA的YAC克隆片段重叠群，在此基础上再进行人基因组计划的大规模测序。 第三节 DNA重组与鉴定重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达。一、DNA重组 重组DNA分子的构建所需的目的基因或DNA片段可来自基因组DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；载体最常用的是质粒、噬菌体及逆转录病毒等；它们在限制性内切酶的作用下，可形成粘性末端或平齐末端，在DNA连接酶的作用下可连接成一个DNA重组体。（一）目的DNA片段与载体的连接 主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术，所谓DNA重组，就是指把外源目的基因“装进”载体过程，即DNA的重新组合。这种重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称异源嵌合DNA。 载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段与之共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。作为载体DNA分子，必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达能力，这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯；载体上应具有两个以上的容易检测的遗传标记，以区分阳性重组分子和阴性重组分子。选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点，以便从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。载体上的酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否连进载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，便于筛选重组体。DNA重组本质上是一个酶促生物化学过程， DNA连接酶是其中的重要角色。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶中赖氨酸的氨基形成磷酸-氨基键而连接产生酶-ATP复合物；然后酶-ATP复合物活化DNA链5端的磷酸基团，形成磷酸-磷酸键；最后DNA链3端的羟基活化并取代ATP，与5端磷酸基团形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。大肠杆菌 DNA连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子是NAD +而不是ATP。具有相同粘性末端的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，连接酶利用这个相对稳定的结构，行使间断修复的功能，就可以使两个DNA分子连接在一起。大肠杆菌 DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，但T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即使两端平端的双链DNA分子连接起来的功能。对于这种连接反应的机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效果比粘性末端的连接效果要低的多，可能是因为末端DNA分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。可通过增加DNA的浓度或提高T4噬菌体DNA连接酶浓度来提高平末端的连接效率。连接反应的一项重要参数是温度。理论上说，连接反应的最佳温度是37，此时连接酶的活性最高。但37时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即1216。此时既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。进行DNA重组的方法有很多，主要有粘端连接法、平端连接法，后者包括平接法和接头法以及粘-平端连接法。这些方法的采用主要依据外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶酶切位点的性质来做选择。1.粘性末端连接法：若目的基因或DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同一种内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。粘性末端连接（cohesive end ligation）得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点，因此，可以使用原切割内切酶，重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。在粘性末端连接时，除重组体外，还有一定数量的载体自身环化分子，这将产生较高的假阳性克隆背静。针对这一问题，往往需要在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体的5磷酸以抑制质粒DNA的自身环化。另外，如果用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA，连接时插入片段可以两个方向插入载体中。粘性末端连接时还有一个问题是片段的多拷贝插入。欲筛选出含有正确插入方向和单拷贝插入片段的重组体，需要将重组体进行内切酶图谱分析。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：载体摩尔数为3：1。2.同聚体加尾部连接法 同聚体加尾部连接法（homopolymeric tails ligation）即当目的基因或DNA片段与载体，用限制性内切酶酶切获得的是平齐末端；或者外源DNA片段和载体是两个不相配的DNA片段；此时可用末端转移酶使其中的一个DNA分子3端上接上多聚A,另一个DNA片段3端上接上多聚T。这样两个DNA分子的尾部可按A-T配对原则相联，并由DNA聚合酶填补空隙，最后由DNA连接酶封口成重组DNA分子。3.人工合成接头连接法 人工合成接头连接法（artifical linker ligation）即目的基因或DNA片段的两端接上能够被某一限制性内切酶识别的DNA序列（接头），再在该酶的酶解作用下，和载体获得相同的粘性末端，并进行连接。见图7-9。 (二)重组DNA分子转入宿主细胞体外重组生成的重组子必须导入合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。宿主细胞以大肠杆菌为代表的原核细胞和包括哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核细胞。对不同的宿主细胞应采取不同的方法导入DNA，但都以获得尽可能多的转化宿主细菌或细胞为前提。1.重组DNA分子导入原核细胞 将重组的DNA分子引入细菌(原核细胞),使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化作用(transformation)。最常用的细菌是大肠杆菌，要选择合适的菌株。细菌在生长过程中，只有某一阶段的细菌才能成为转化的接受体，这一生理状态称为感受态（competent）。（1）CaCl2处理以后的转化: 当细菌处于0、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42短时间热冲击后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖，该方法的转化效率为每微克DNA可获得105-106转化子。环状DNA比线状DNA分子转化效率高1000倍左右。本法的关键是选用的细菌必须处于生长对数期，实验操作必须在低温下进行。（2）电击法: 也称电穿孔法，电击法（electroporation）最早用于将DNA导入真核细胞，利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。除需特殊仪器外，它比CaCl2操作简单，无需制备感受态细胞，适用于任何菌株。其转化效率较高，每微克DNA可以得到109-1010转化子。2.重组DNA分子导入真核细胞 将噬菌体、病毒或或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程称为转染（transfection）。（1）CaCl2处理以后的转染： 这是将重组的噬菌体DNA导入细胞的常规方法。这时的真核细胞一定要经一定浓度的冰冷的CaCl2（50100mmol/L）溶液处理以后成为感受态细胞，感受态细胞有摄取各种外源DNA的能力。（2）电击法：利用脉冲电场将DNA导入受体细胞，它的导入效率受到很多因素的影响，如外加电场的强度：对大多数的哺乳动物细胞来说，一般控制在250750v/cm较适宜；工作温度：对不同类型的细胞要求有所不同，可在0至25的范围内选择；DNA的构象和浓度：线形DNA比环状DNA要好，浓度宜控制在140g/ml。此外，缓冲液的离子成分也对DNA的导入效率有一定影响，一般盐溶液的导入效果较好。对于磷酸钙共沉法等不能导入的受体细胞，高压电穿孔法是一个可解决的方法，但它需要专门的仪器设备，导入前还必须进行预实验，针对不同的对象，选择最佳条件。（3）聚乙二醇介导的转染法：此法一般用于转染酵母细胞以及其他真菌细胞。细胞用消化细胞壁的酶处理以后变成球形体，在适当浓度的聚乙二醇6000的介导下，将外源DNA导入受体细胞。（4）磷酸钙-DNA共沉淀法：将外源基因导入哺乳细胞中进行