米非司酮配伍顺铂对卵巢癌耐药细胞株CAOV3DDP细胞凋亡和性激素受体.doc

芅螈螄莄莇薁肃莄葿螇罿莃薂蕿袅莂莁螅袁羈蒄蚈螇羈薆袃肆羇芆蚆羂羆莈袁袇羅蒀蚄螃肄薃蒇肂肃节蚃羈肂蒄蒅羄肂薇螁袀肁芆薄螆肀荿蝿肅聿蒁薂羁肈薃螇袇膇芃薀螃膆莅螆虿膆薈蕿肇膅芇袄羃膄莀蚇衿膃蒂袂螅膂薄蚅肄芁芄蒈羀芀莆蚃袆芀葿蒆螂艿膈蚂螈芈莀薅肆芇蒃螀羂芆薅薃袈芅芅螈螄莄莇薁肃莄葿螇罿莃薂蕿袅莂莁螅袁羈蒄蚈螇羈薆袃肆羇芆蚆羂羆莈袁袇羅蒀蚄螃肄薃蒇肂肃节蚃羈肂蒄蒅羄肂薇螁袀肁芆薄螆肀荿蝿肅聿蒁薂羁肈薃螇袇膇芃薀螃膆莅螆虿膆薈蕿肇膅芇袄羃膄莀蚇衿膃蒂袂螅膂薄蚅肄芁芄蒈羀芀莆蚃袆芀葿蒆螂艿膈蚂螈芈莀薅肆芇蒃螀羂芆薅薃袈芅芅螈螄莄莇薁肃莄葿螇罿莃薂蕿袅莂莁螅袁羈蒄蚈螇羈薆袃肆羇芆蚆羂羆莈袁袇羅蒀蚄螃肄薃蒇肂肃节蚃羈肂蒄蒅羄肂薇螁袀肁芆薄螆肀荿蝿肅聿蒁薂羁肈薃螇袇膇芃薀螃膆莅螆虿膆薈蕿肇膅芇袄羃膄莀蚇衿膃蒂袂螅膂薄蚅肄芁芄蒈羀芀莆蚃袆芀葿蒆螂艿膈蚂螈芈莀薅肆芇蒃螀羂芆薅薃袈芅芅螈螄莄莇薁肃莄葿螇罿莃薂蕿袅莂莁螅袁羈蒄蚈螇羈薆袃肆羇芆蚆羂羆莈袁袇 米非司酮配伍顺铂对卵巢癌耐药细胞株CAOV3/DDP细胞凋亡和性激素受体的影响易达论文网论文发表 代写医学论文 职称论文代写 医学论文发表 护理论文【摘要】 目的 探讨米非司酮配伍顺铂对卵巢癌耐药细胞株CAOV3/DDP增敏作用以及凋亡率、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的影响。方法 采用RPMI1640培养液对CAOV3/DDP细胞株进行培养，将CAOV3/DDP细胞株分5组：对照组(不加任何药物)、顺铂组(2 g/ml)、高剂量米非司酮加顺铂组(15 g/ml米非司酮和2 g/ml顺铂)、中剂量米非司酮加顺铂组(10 g/ml米非司酮和2 g/ml顺铂)、低剂量米非司酮加顺铂组(5 g/ml米非司酮和2 g/ml顺铂)。培养结束后采用MTT法观察不同浓度的米非司酮配伍顺铂对CAOV3/DDP细胞株增殖活力的影响;采用流式细胞术观察不同浓度的米非司酮配伍顺铂对CAOV3/DDP细胞株凋亡率、ER、PR的影响。结果 与对照组比较，顺铂组对细胞增殖活力、细胞凋亡率以及ER、PR阳性率的影响，差异均无统计学意义(P0.05);与顺铂组比较，各剂量米非司酮加顺铂组对细胞增殖活力、生存率以及细胞凋亡率、PR阳性率的影响，差异均有统计学意义(P0.05，P0.01)，且随着米非司酮浓度的升高，对CAOV3/DDP细胞抑制作用逐渐增强，细胞凋亡率显著上升，PR阳性率下降(P0.05，P0.05)。结论 米非司酮联合顺铂对CAOV3/DDP细胞增殖活力均具有显著抑制作用，且与米非司酮的浓度呈剂量依赖关系，米非司酮可提高顺铂化疗的敏感性，其增敏作用与抑制孕激素分泌，促进卵巢癌细胞凋亡有关。【关键词】 米非司酮;顺铂;卵巢癌;细胞凋亡;雌激素受体;孕激素受体Effects of mifepristone and cisplatin on apoptosis and hormonal receptors in chemoresistant ovarian cancer cell lines CAOV3/DDPXING Ying, WANG Liying. The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000【Abstract】 Objective To study the effects of mifepristone and cisplatin (DDP) on cell proliferation, apoptosis, estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) in chemoresistant ovarian cancer cell lines CAOV3/DDP. Methods CAOV3/DDP cells were cultured by RPMI1640 medium, and treated with different doses of medications: control group (without medication),DDP group (2 g/ml), highdose mifepristone combined with DDP group (15g/ml mifepristone and 2 g/ml DDP), mediumdose mifepristone combined with DDP group(10 g/ml mifepristone and 2 g/ml DDP)and lowdose mifepristone combined with DDP group(5 g/ml mifepristone and 2 g/ml DDP). Cell proliferation activity, apoptosis, ER and PR were evaluated by MTT method, FCM respectively.Results Compared with control group, the cell proliferation activity, apoptosis rate, ER and PR in DDP group and lowdose mifepristone group have no statistical significance(P0.05).Compared with DDP group, cell proliferation activity, apoptosis rate, expression of ER and PR in each group of mifepristone combined with DDP have statistical significance(P0.05 or P0.05). Conclusion Mifepristone combined with DDP can induce cytoinhibition in a concentration dependent manner in ovarian cancer CAOV3/DDP cells, suggesting that mifepristone could obviously increase the chemosensitivity of DDP by inhibiting PR and increasing apoptosos.【Key words】 mifepristone; cisplatin; ovarian cancer; apoptosis; estrogen receptor; progesterone receptor卵巢癌是性激素依赖性肿瘤，内源性和外源性雌激素和孕激素可经受体机制诱发肿瘤细胞生成细胞生长因子，经自分泌和旁分泌机机制调控卵巢肿瘤的发生和发展1。米非司酮是有效的抗孕酮药物，可作为竞争性拮抗剂作用于孕激素受体。目前研究发现2，米非司酮对体外培养的卵巢癌细胞生长具有显著的抑制作用，但其确切的作用机制尚未完全明了。为此，课题组采用MTT法检测米非司酮联合顺铂时对耐药卵巢癌细胞的生长抑制作用，采用流式细胞术观察不同浓度的米非司酮联合顺铂对CAOV3/DDP细胞株凋亡率以及雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的影响，以探讨米非司酮增敏作用机制，为临床应用米非司酮治疗难治性卵巢癌提供实验依据，现报道如下。1 材料与方法1.1 材料药物、细胞株及主要试剂：米非司酮纯品：由北京第三制药厂惠赠;CAOV3/DDP(为耐顺铂，ER和PR阳性)卵巢癌细胞株：购自中国医学科学院细胞中心;MTT溴化(4，5二甲2噻唑基)2，5二苯基四氮唑、胰蛋白酶：购自Sigma公司;RPMI1640培养基：含10% 新生牛血清、1%谷氨酰胺、青链霉素各100 U/ml，购自Gibco公司;ER、PR免疫单克隆抗体试剂盒、FITC标记羊抗鼠IgG抗体：购于美国SantaCruz公司。仪器：MK3型酶标仪，芬兰雷勃;CO2培养箱，美国Revco;超净工作台，中国哈尔滨;低温离心机，中国上海;EPICS型流式细胞仪(美国Coulter公司)，激光波长488 nm，空气冷却15 mW氩离子激光作为光源。1.2 细胞培养CAOV3/DDP细胞株冻存于液氮中，用时进行复苏。培养液为RPMI1640培养液，含10% 新生牛血清、1%谷氨酰胺、青链霉素各100 u/ml，在375% CO2饱和湿度培养箱中培养，待细胞长满培养瓶底后，倒掉培养液，用DHanks液轻轻荡洗1次，加入浓度为0.25%的胰蛋白酶液，消化23 min，吸弃消化液，进行实验。1.3 实验分组将CAOV3/DDP细胞株分5组：对照组(不加任何药物)、顺铂组(2 g/ml)、高剂量米非司酮加顺铂组(15 g/ml米非司酮和2 g/ml顺铂)、中剂量米非司酮加顺铂组(10 g/ml米非司酮和2 g/ml顺铂)、低剂量米非司酮加顺铂组(5 g/ml米非司酮和2 g/ml顺铂)。1.4 MTT法细胞存活力测定上述各组细胞均在RPML1640培养液中继续培养，细胞悬浮生长至对数生长期，调整细胞浓度至4103个/ml混匀后加入96孔板中，每孔100 l，每组共计10孔，于37、5%二氧化碳培养箱培养48 h后，每孔再加入5 mg/ml MTT 10 l，37继续培养4 h，高速离心机1 000 r/min离心10 min，用加样器小心吸去上清液，各孔中加入二甲亚砜，每孔100 l，震荡20 min后，用酶标仪(=570 nm)测定其光密度值(OD)。并根据下式计算生存率：生存率=OD给药组/OD对照组100%1.5 FCM检测1.5.1 单细胞悬液制备：上述各组细胞均在RPML1640培养液中继续培养，细胞悬浮生长至对数生长期，直接吹打下贴壁细胞，用PBS液洗涤细胞2次，同时用6号针头抽吸2次，使细胞尽量分散开成单个细胞，70%乙醇固定，4保存待测。1.5.2 细胞DNA染色：取CAOV3/DDP细胞1105/ml 0.1 ml，加入10%鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，加入碘化丙啶(PI)(PI：50 mg/L, tritonx100 1.0%)1 ml，在4冰箱染色30 min，以500目铜网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，即可上机检测。1.5.3 ER、PR蛋白免疫荧光样品的制备：取单细胞悬液1106/ml 1ml，加入1100的鼠抗人ER蛋白单克隆抗体工作液100 l，室温孵育30 min，加入PBS 10 ml洗涤1次，弃上清液，加入1100的羊抗鼠FITCIgG二抗工作液100 l，避光室温孵育30 min，加入PBS 10 ml离心洗涤，弃上清液，以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS 0.1 ml，经500目铜网过滤后即可上机检测。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗和二抗的阳性对照。PR蛋白免疫荧光样品制备步骤及剂量同上，一抗为1100稀释的鼠抗人PR蛋白单克隆抗体，二抗为1100稀释的羊抗鼠FITCIgG。1.5.4 FCM检测条件与参数：采用美国Coulter公司生产的EPICS型流式细胞仪，激光光源为空气冷却15 mW氩离子激光器，激光波长为488 nm，DNA检测以线性方式采集数据，免疫荧光检测以对数方式采集数据，测量的数据输入EXPO 32计算机进行处理并打印出结果。检测前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器CV值在5%以内。1.6 统计学分析数据处理运用SPSS 13.0统计软件，各组间比较采用单因素方差分析，P0.05);各剂量米非司酮加顺铂组与顺铂组比较对细胞增殖活力和生存率的影响，差异有统计学意义，且随着米非司酮浓度的升高，对CAOV3/DDP细胞抑制作用逐渐增强(P0.05、P0.01);中、高剂量米非司酮加顺铂组与低剂量米非司酮加顺铂组比较，细胞增殖活力和生存率有统计学意义(P0.01);高剂量米非司酮加顺铂组与中剂量米非司酮加顺铂组比较，细胞增殖活力和生存率有统计学意义(P0.01)，见表1。表1 不同浓度的米非司酮联合顺铂对 CAOV3/DDP细胞增殖活力的影响(略)注：与对照组比较，*P0.01;与顺铂组比较，#P0.05，P0.01;与低剂量米非司酮加顺铂组比较，P0.01;与中剂量米非司酮加顺铂组比较，P0.05);与顺铂组比较，各浓度米非司酮加顺铂组细胞凋亡率、PR阳性率具有统计学差异(P0.05、P0.01)，且随着米非司酮浓度的升高，细胞凋亡率显著上升，PR阳性率下降(P0.01)。中、高剂量米非司酮加顺铂组与低剂量米非司酮加顺铂组比较，凋亡率、PR阳性率有统计学意义(P0.01);高剂量米非司酮加顺铂组与中剂量米非司酮加顺铂组比较，凋亡率、PR阳性率有统计学意义(P0.05)，见表2。表2 不同浓度的米非司酮联合顺铂对CAOV3/DDP细胞凋亡率以及ER、PR阳性率的影响(略)注：与对照组比较，*P0.01;与顺铂组比较，#P0.01;与低剂量米非司酮加顺铂组比较，P0.01;与中剂量米非司酮加顺铂组比较，P0.013 讨论卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，病死率居首位，60%70%的卵巢上皮性癌患者就诊时已属晚期，预后极差2。由于早期诊断问题远未解决，肿瘤细胞减灭术和以顺铂为主的多药联合化疗是目前治疗卵巢癌的主要手段，但在临床中至少80%的化疗患者出现获得性耐药，肿瘤细胞对顺铂的耐药性大大影响了化疗效果，其5年生存率仅为30%40%。目前，肿瘤细胞对抗癌药物产生耐受正成为化疗成功的最主要障碍，深人研究卵巢癌耐药机制、探索如何逆转耐药一直是妇科肿瘤研究的热点3。米非司酮是一种孕激素和糖皮质激素受体拮抗剂，临床上主要用于终止早孕、紧急避孕和引产等4，5。近十年来的研究表明，米非司酮对多种人体肿瘤的形成和生长具有潜在的选择性抑制作用，尤其在抑制卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌等妇科恶性肿瘤细胞增殖的体外研究已有报道。对米非司酮治疗卵巢期临床研究表明6，34例对顺铂加紫彬醇治疗耐药的复发性卵巢癌患者接受米非司酮治疗，总缓解率达25.6%，完全缓解者平均存活31个月，1例存活超过3年。提示米非司酮可逆转顺铂耐药，可作用化疗增敏剂于临床，这为探索多药联合应用的化疗方案，提供了全新的思路但其确切的作用机制尚不清楚。卵巢癌是性激素依赖性肿瘤，具有较高的雌、孕激素受体表达，并具有分泌雌、孕激素的功能，雌、孕激素与其受体相互作用在卵巢癌的发生和发展中起重要作用，并在某种程度上可以反映患者的预后。李强等7研究发现，内源性和外源性雌、孕激素拮抗剂可以减少卵巢癌的发生率，采用人卵巢上皮癌细胞株CAOV3/DDP细胞制备裸鼠移植瘤模型，观察孕激素拮抗剂米非司酮对裸鼠移植瘤生长速率、肿瘤体积、重量、细胞增殖和凋亡活性的影响，结果显示，米非司酮可显著抑制卵巢癌裸鼠移植瘤的增殖，促进肿瘤细胞凋亡，肿瘤的体积和重量均较对照组显著减小。另据报道8-9，米非司酮有诱导不同类卵巢癌细胞凋亡的作用，呈剂量和时间依赖性抑制人卵巢上皮癌3AO细胞体外增殖活性，其抑制作用与PR变化相关。提示米非司酮可逆转顺铂耐药，可作为化疗增敏剂用于临床，这为探索多药联合应用的化疗方案，提供了全新的思路。本项研究采用MTT法对顺铂耐药的CAOV3/DDP细胞系进行体外实验，采用流式细胞术观察不同浓度的米非司酮配伍顺铂对CAOV3/DDP细胞株凋亡率、ER、PR阳性率的影响，结果表明，与顺铂组比较，不同浓度的米非司酮加顺铂均可明显降低CAOV3/DDP细胞增殖活力，且随着米非司酮浓度的升高，对CAOV3/DDP细胞抑制作用更加明显，表明米非司酮可提高顺铂化疗的敏感性，且与米非司酮的浓度呈现剂量依赖关系;与顺铂组比较，各浓度米非司酮加顺铂组细胞凋亡率、PR阳性率具有统计学差异，且随着米非司酮浓度的升高，细胞凋亡率显著上升，PR阳性率明显下降，说明米非司酮的增敏作用与抑制性激素分泌，促进卵巢癌细