氧化三甲胺酶对海洋鱼类的研究进展.docVIP

氧化三甲胺酶对海洋鱼类影响的研究进展摘要氧化三甲胺脱甲基酶(TMAOase) 能催化氧化三甲胺(TMAO)分解成二甲胺(DMA) 和甲醛( FA)是许多海洋鱼类体内产生甲醛的重要的酶，并且与水产品甲醛的本底含量和鱼肉的腐败变质密切相关。本文对TMAOase的分布、活性测定、分离纯化以及酶学特性等方面研究进行了较为全面的综述。关键词：氧化三甲胺酶；甲醛；研究进展鱼肉在冷冻和冰冻贮存过程中，肌肉组织中的三甲胺(TMAO)在氧化三甲胺酶(trimethylamine-N-oxide demethylase，TMAOase)的作用下分解为二甲胺(dimethylamine，DMA)和甲醛(formaldehyde，FA)1-3。DMA和FA是一种重要的食品安全危害因子，食用可直接对人体产生产生毒害作用。同时FA对许多鱼类产品腐败变质还有重要作用，FA与肌肉中的蛋白质发生反应导致鱼肉质构变差、疏水性增加，导致鱼肉质量变差甚至变质4。TMAOase在国外已经引起了科学家的广泛关注，并且把甲醛的含量和TMAOase的活性作为衡量鱼类产品腐败变质的指标5。TMAOase活性主要是通过测定其底物TMAO的代谢产物DMA和FA来衡量，这在许多鱼类组织中尤其是在鳕鱼类组织器官中得到检测和证实，但是反应的机理和TMAOase生理作用还不清楚6。在国内该酶的研究报道较少，只见到FA产生机理的综述文章7，本文就近年来TMAOase的研究进展进行较为全面的综述。1 TMAOase 的种类和来源TMAOase是可以将TMAO分解为DMA和FA的一类酶系统，包括trimethylamine oxide aldolase，trimethylamine-N-oxide formaldehydelyase，trimethylamine-N-oxide demethylase8-10。1963年，Amona等11在研究鱼类中甲醛时就提出甲醛的产生和代谢可能与某一种酶相关。1965年，Yamada和Amano12发现在Alaska绿鳕(Theragra chalcogramma)幽门盲肠中存在一种因子可以分解TMAO，氧气对其活性有很大的抑制作用，pH5.0时表现出最大活性，此因子具有酶的特性，且与氧化三甲胺分解有关，所以被称作氧化三甲胺酶。到目前为止，人们一直认为TMSOase是一种多酶体系，但其种类和详细组成仍不清楚。1982年，Gill等14用不同的等电点(主要是酸性pH范围)从鳕鱼(Gadu smorhua)肾脏中分离出四种TMAOase的同工酶，最适pH为5.0，亚甲基蓝可激活酶使其达到最大活性，但酶的活性不受氧气浓度影响。1982年Lundstrom15证实了红鳕肌肉中存在TMAOase活性，且该酶活性中心的离径范围大于0.1。1983年Reece16报道了在鳕鱼肌肉中存在两种有TMAOase活性的酶，其中一种酶受氧气和氰化钾抑制，而另一种酶不受这两种因子影响。Gill14认为TMAOase主要集中在溶酶体膜上，而Parkin等17从红鳕(Urophycis chuss)肌肉微粒体中分离出一种有TMAOase活性的组分，SDS-PAGE电泳显示该酶由数种蛋白组成。1992年Joly18等通过阴离子交换层析，从绿鳕(Pollachius virens)肾脏中分离出三种高分子量(2002000kDa)的独立的酶，它们的等电点不同，分别是4.1、4.5、5.0。2 TMAOase 的分布TMAOase广泛分布于海产动物组织中，在鱼类中白肉鱼中的含量比红肉鱼多，而在淡水动物中则没有TMAOase，即使存在含量也极微。在一些深海鱼类中，特别是在鳕鱼类中的含量较高，如狗鳕、鳕、黑线鳕、蓝牙鳕、牙鳕、绿鳕、红鳕等，这些鱼都是商业价值很高的鱼类。冷冻或者冰冻鳕鱼片是保持鳕鱼类质量的一种常规贮存方法，但是鳕鱼类体内TMAOase活性很高，即使在冷冻或冰冻状态TMAOase仍然存在活性19。此外，在贝类13、褐虾20以及长舌鲷13中也发现了TMAOase活性。TMAOase在同一种鱼类各个组织器官中的分布也不同。Gill等14报道TMAOase主要集中在内脏器官和红肉中；Rehbein等6报道TMAOase大部分存在于肾脏和脾中，但是在肌肉中少有发现；Tomioka等21发现Alaska绿鳕幽门盲肠存在较高的TMAOase活性；红鳕17 , 19和Alaska绿鳕22肌肉中存在TMAOase活性。由此可见，TMAOase存在于许多鱼类组织中，尤其是内脏器官如肾脏、脾、肝脏和幽门盲肠中。3 TMAOase 的分离纯化方法TMAOase的分离纯化是研究酶学性质的前提和基础，据现有文献报道，不同的学者采用的方法不尽相同。较为常用的方法有四种：硫酸胺沉淀法12、等电点分离法14、离子交换层析法8和DEAE纤维素和凝胶过滤法22。一般用到的组织材料为幽门盲肠、肝脏、胆囊、肾脏、肌肉微粒体和血液等。但这些方法得到的酶的纯度仍然不令人满意。最近又出现了一种利用基因工程的方法合成TMAOase9，这种方法获得的酶纯度高、特异性强，有利于进一步研究酶的性质。2008年冯慧等从印度洋鸢乌贼肌原纤维中提取TMAOase，先采用酸处理和热处理，然后通过DE52阴离子柱层析和Sep hacryl S - 300凝胶柱层析，将TMAOase最终纯化300倍，回收率为32.4%4 TMAOase 酶学特性的研究鳕鱼类在冷冻贮存过程中，由于TMAOase的作用产生了FA ，导致了这些鱼类质量严重下降，基于这个原因，促使许多学者以鳕鱼类为实验材料对TMAOase进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。4.1 酶活测定综合多位学者的测定方法，TMAOase活性可以通过测定组织中产生的DMA或FA来衡量，即在有辅助因子存在的情况下，以TMAO为底物，测定TMAOase活性，TMAOase一个活性单位(U)可用每分钟产生的1molDMA或FA来表示8,21-22。酶的活性在不同品种和同一品种的不同个体之间有很大差异。Nielsen等10对24种鳕鱼类鱼肉样品进行分析，发现只有9种存在TMAOase活性。冻存试验表明鳕鱼肌肉中的TMAOase活性与冻存温度和时间有关。TMAOase活性还与不溶性蛋白和高离子浓度的可溶性蛋白的比例有关10。4.2 TMAOase 的辅助因子Yamada12等研究发现亚甲基蓝可增强TMAOase活性，同时证明了氧气对TMAOase有很大的抑制作用。1980年，Tokunaga23报道TMAOase催化TMAO产生FA的过程可被肌红蛋白和血红蛋白激活。Benjakul等8发现促进TMAOase活性需要FeCl2、抗坏血酸盐和半胱氨酸等辅助因子。Parkin等17认为有两种辅助因子系统能激活TMAOase的活性：一种是厌氧条件下的NADH和FMN系统；另一种系统是由铁和半胱氨酸和/或抗坏血酸盐组成的，在有氧或缺氧时启动。每一种辅助因子系统内的成分互相作用，且已建立了各自的动力学参数。作为鱼肉中普遍存在的胺组分之一，TMAO是唯一可被TMAOase脱甲基的底物。在TMAO脱甲基的过程中这两种辅助因子系统共用一个催化单元。Lundstrom15也报道了抗坏血酸盐、亚甲基蓝和少量的Fe2+、半胱氨酸对红鳕肌肉中的TMAOase活性有促进作用。4.3 TMAOase 的分子量和动力学研究2000年，Kimura22等研究发现Alaska绿鳕(Theragrachalcogramma)肌肉粗酶液中TMAOase的酶活最适pH为7.07.5，在30以上则检测不到活性，经测定得知该酶的分子量约为400kDa，底物TMAO的Km=30mmol/L，活化能为38.4kJ/mol。1999年，Havemeister5研究了牙鳕(Merlangiusmerlangus)中TMAOase的活性，他分离出两种TMAOase组分，其中高分子量(2000kDa)组分是一种膜蛋白，低分子量(150600kDa)组分是可溶性的。25pH4.55.0时TMAOase活性最大，40加热20min两种组分仍然保持稳定，底物TMAO的Km=5.711.5mmol/L，活化能范围是5.26.0kJ/mol。2003年Benjakul8等从长舌鲷(Saurida micropectoralis)肾脏中部分纯化出TMAOase，其最适pH为7.0，最适温度为50，对TMAO的Km值为16.2mmol/L，活化能为30.54kJ/mol，根据SDS-PAGE估测酶的分子量为128kDa。2004年Mar Rey-Mansilla24等通过离子交换层析从欧洲狗鳕(Merluccius merluccius)肾脏中分离出2种TMAOase活性蛋白质组分：第一种组分用浓度为0.45mol/L，NaCl洗脱，其电荷/质量与牛血清蛋白相似，分子量在30100kDa之间；第二种组分用浓度为0.7mol/L，NaCl洗脱，它的电荷/质量很低，可能是由1002000kDa之间的高分子量蛋白质聚集形成的。TMAOase形成多聚体从而构成疏水环境，导致它本身的高疏水性，这与其低溶解性一致。两种组分中的蛋白质的等电点为pH为4.555.85。4.4 TMAOase 的活性部位2003年，Takeuchi等9对TMAOase的活性部位进行研究时，从绿鳕(walleyepollack)中克隆出一组富含天冬氨酸的蛋白质。其中一种cDNA被指定为aspolin1，编码一种富含天冬氨酸的228个氨基酸的蛋白质，在Ala42和Asp43之间剪切后为成熟的TMAOase。成熟的aspolin1/TMAOase蛋白为186个氨基酸，其中含有179个Asp。另一个cDNA被指定为aspolin2，在5端与aspolin1共用一段核苷酸序列，编码的蛋白含有一个附加的Asp聚合体和一个富含半胱氨酸的C-末端。aspolin2的氨基酸序列与哺乳动物的富含组氨酸的Ca2+结合蛋白高度同源。Aspolin1/TMAOase和aspolin2的mRNA在骨骼肌中最丰富，在肾、心、脾和脑中可检测到较低水平的mRNA。人工合成Asp聚合体表明，有Fe2+存在时TMAOase的活性显著增强，但是单体和寡聚体却没有活性。纯化的TMAOase蛋白与Fe2+结合能力较低，这可能是造成催化活性较低的原因。当鱼死后在贮存过程中，天冬氨酸和Fe2+形成复合体，参与TMAO去甲基化生成甲醛。4.5 去污剂对TMAOase 活性的影响Parkin等17研究了从鱼肉微粒体纯化TMAOase的过程中去污剂对其活性的影响。当每mg蛋白质中去污剂的浓度低于10mg时，Tritons X-100和X-45、deoxycholate、Brijs、Tweens20、65和80，以及SDS等去污剂对从膜上分离到的可溶性TMAO成分几乎没有影响，但对颗粒部分的活性影响很大。如在5mmol/L组氨酸，pH7.01014的环境下，每mg蛋白中添加10mgSDS，可以将酶高度浓缩。在此SDS含量下，酶的活性也相对稳定。用SDS处理后，如果再同时用抗坏血酸和FMN-NADH分别处理，TMAO的活性可以分别提高28到58倍。如果在纯化时添加尿素或2-巯基乙醇，或用超声波处理SDS-微粒体悬浮液，则上述活性就会显著下降。这些TMAOase纯化物只有原来微粒体蛋白质中的1%。纯化物的活性与铁离子呈曲线关系，与半胱氨酸呈S形关系。与微粒体相比，TMAOase纯化物利用NADH 、FMN和抗坏血酸的能力各不相同。5 展 望目前国外对于TMAOase已经以鳕科鱼类为试材进行了大量的研究，发现不同鱼类、不同方法提取的TMAOase物理化学性质存在很大差异，而国内对该酶研究的还较少。我国是世界上最大的水产大国，水产品在我国国民经济中占有很重要的地位，水产品蛋白质很丰富，蛋白质变性是水产品贮存常常遇到的一个问题，而TMAOase分解TMAO形成DMA和FA，不仅易引起鱼类组织变差，而产生的FA对水产品的质量安全是一个不容忽视的问题。为了防止TMAOase活性和产生甲醛对水产品品质造成影响，我们需要了解不同种类的鱼和同一种类鱼的不同组织器官中TMAOase分布及活性的基本信息。因此，必须进一步对TMAOase的作用机理和性质进行研究，从而提出抑制甲醛产生技术和办法，保证水产品的质量安全。参考文献：1 CASTELLCH, SMITHB,NEALW. 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