层析分离技术.ppt

第八章 层析分离技术,层析技术的发展历史： 层析法也称色谱法，1906年，俄国植物学家茨维特，在研究植物色素过程中创立了吸附层析分析法。吸附通常是指固体或液体表面对气体或溶质的吸着现象。一些固体物质，如碳酸钙、氧化镁、活性炭等，对气体或溶质有吸附作用，被称为吸附剂。吸附层析就是利用吸附剂的吸附作用，把几种色素的混合物分成层，进而把它们分离开的一种技术。,茨维特将一根玻璃管的一端塞上一团棉花，在管中填入粉末状的吸附剂，使几种植物色素溶液经过该玻璃管，由于吸附剂对各种色素具有不同的吸附能力，留在管的最上面的是叶绿素，下面是二、三种黄色的叶黄素，最下层是另一种黄色的胡罗卜素。在玻璃管中（可以叫做吸附柱），原来混合的色素被分成有规则的色层，与光谱非常相似。茨维特用纯溶剂对每一层进行洗涤，使每一层进一步分离，最后把分成色层的吸附剂圆柱底色层小心切开，再用醇作溶剂将各层分别溶解。这样得到的溶液是各种单一色素的纯溶液。由此得名为“色谱法”（chromatography) 。,后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 英国生物学家martin和synge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析（hplc）等。,层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。 层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产，还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。,层析的基本概念 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 层析：以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。 操作容量：在一定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般是以每克基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数。,床体积：膨胀后的基质在层析柱中所占的体积（vt） 洗脱体积：某一成分从柱顶端到底部的洗脱液中出现浓度最大值时流动相的体积。 （ve） 基质体积：基质本身的体积（vg） 膨胀度：在一定溶液中单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积 分配系数 k： 指某一组分在固定相与流动相中含量的比值 迁移率 rf：指某一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离的比值。,层析法的基本原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,塔板理论 塔板(塔片)理论是把色谱柱看作一个分馏塔，在每个塔板的间隔内，样品混合物在气液两相中达到分配平衡。经过多次的分配平衡后，分配系数小的组分(挥发性大的组分)先到达塔顶(先流出色谱柱)。由于色谱柱的塔板相当多，因此分配系数的微小差别，即可获得很好的分离效果。 混合物在层析柱中的分离过程，实际上是吸附、解吸附、再吸附的连续过程，或者是在固定相与流动相之间连续分配的过程。,层析技术的分类 (1) 按流动相的状态分类：用液体作为流动相的称为液相层析，或称液相色谱；以气体作为流动相的称为气相层析，或称气相色谱。 (2) 按固定相的使用形式分类：可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈钢管中构成层析柱)、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。 (3) 按分离过程所主要依据的物理化学原理分类：可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。本章按第三种分类进行叙述。,第一节 吸附层析,吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法。 吸附层析在各种层析技术中应用最早，由于吸附剂来源丰富，价格低廉，易再生，装置简单 ，又具有一定的分辩率等优点，故至今仍广泛使用。,凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。在吸附层析中应用的吸附剂一般为固体。 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的，故在一定的条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称为解吸作用。 吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的。本节主要介绍吸附柱层析,薄层吸附层析将在本章第六节介绍。,一、吸附柱层析,将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，构成层析柱，层析时欲分离的样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗。冲洗的过程称为洗脱，加入的溶剂称为洗脱剂。,在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附，后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。,不同的物质由于吸附力和解吸力不同 ，移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快。经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带(色层)。如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线。吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。,(一) 吸附剂的选择,常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型的吸附剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说， 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。,羟基磷灰石 羟基磷灰石ca5(po4)3oh2，简称ha的吸附容量高，稳定性好(在t85，ph5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如rna、双链dna、单链dna和杂合型双链dna-rna等，经过一次ha柱层析，就能达到有效的分离。 ha的ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用ha分离生物分子过程中起着重要作用。而ha的po43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。,2. 硅胶 是最常用的吸附剂，通常用sio2.xh2o表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。 水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110加热30min ，吸附能力显著增强，这一过程称为活化。如果将硅胶加热到500，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。 硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。,3.氧化铝 分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(ph4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(ph9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(ph7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物。 氧化铝用前也需脱水活化，通常于400高温下加热6h，使氧化铝的含水量在0%-3%之间， 可得到级或级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。 4.大孔吸附树脂和聚酰胺 近年用于中药活性成分的分离。,(二) 洗脱剂的选择 洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。合适的洗脱剂应符合下列条件： 纯度较高； 稳定性好； 能较完全洗脱所分离的成分； 黏度小； 易和所需要的成分分开。,洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。一般蛋白质或核酸被极性强的羟基磷灰石吸附后，要用含有盐的缓冲液洗脱。而甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。所用洗脱剂的浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。 在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用，浓度则由低到高。总之，选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。,(三) 操作,柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统。 1.层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为110- 140。采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。,2.吸附剂的用量 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍,3.装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装法和湿装法两种。干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂。此法不易将气泡排尽。而湿装法系先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。这种装柱法对各种基质都适用。装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在一定的操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间的压力差)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。,4. 上样和洗脱 经过平衡的层析柱，当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2 (当加入的样品量相同时，体积越小越有利于提高分辨率)。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标，有合适的检测器和记录仪时，洗脱液流经检测器再收集，用记录仪可自动绘制洗脱曲线。,为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析)。 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。,第二节 分配层析,分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。 分配系数(k)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值： k=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度 分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。,在分配层析中，通常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂沿固定相流动构成流动相，某溶质在流动相的带动下流经固定相时，会在两相间进行连续的动态分配。当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时，分配系数越小的组分，随流动相迁移的越快。两个组分的分配系数差别越大，在两相中分配的 次数越多，越容易被彻底分离。,纸层析属于典型的分配层析，且系统简单，使用方便，在生物化学的发展中发挥过极其重要的作用。本节主要通过纸层析介绍分配层析的基本知识。 此外，将硅胶、硅藻土等铺在玻璃或金属板上进行层析可构成薄层层析系统，由于薄层层析还可做吸附、离子交换等层析，将在本章第六节专门叙述，在硅藻土上吸附或化学键合一定的溶剂，装到层析柱上，以气体为流动相可构成气液分配层析，即气相色谱系统，在硅胶等固体材料上吸附或化学键合一定的溶剂，装到层析柱中，用一定的洗脱剂洗脱，可构成液液分配层析，这种系统在高效液相色谱中应用普遍。,二、纸层析,(一) 原理 滤纸一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，一般情况下较难脱去。纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。,溶质在滤纸上移动的速率可用rf值表示： rf= a/b 式中a：溶质在固定相移动的距离。 b：流动相移动的距离。 rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，rf值也不相同，由此可以根据rf值的大小对物质进行定性分析。,(二) 影响rf值的主要因素,物质的结构和极性 物质的结构和分子极性是影响rf值的主要因素。极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其rf值就较小，反之亦然。 2.滤纸 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时，所得到的rf值也不相同。 层析滤纸由高纯度的棉花制成。要求质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，并具有一定的纯度。,3.层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，rf值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使rf值的重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分的rf之差最好大于0.05。,溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等。举例如下： (1) 苯酚：重蒸馏，收集180的馏分。 (2) 乙酸：在冰醋酸中加入1%重铬酸钾，蒸馏，收集118的馏分。 (3) 正丁醇：先后用2.5mol/l硫酸溶液和5mol/l氢氧化钠溶液洗涤，再用无水碳酸钾脱水， 用磨口蒸馏器蒸馏，收集117的馏分。,4.ph值 溶剂和样品的ph值会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使rf值改变。为了避免或减少ph值对rf值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的ph值，通过调节溶剂或样品溶液的ph值，使ph值保持恒定。 5.温度 温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积；同时在多元溶剂系统中，温度显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。所以温度的改变使rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。,6.展开方式 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同的展开方式进行层析时，所得到的rf 值不相同。用下行法展开时，rf值较大；用上行法展开时，rf值较小。 7.样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时，有时对rf值有所影响。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的rf 值。,(三) 操作方法,1.样品处理 用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定的ph值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释。 2.点样 将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用血球计数管或微量注射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的量为5-30g。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。,3.平衡 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统的组成，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿，严重影响层析效果。平衡一般在密闭的层析缸内进行。,4.展开 平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。 按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环行三种方式。 (1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，但展开时间较长。 (2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但rf值的重现性较差，斑点易扩散。,(3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特制滤纸。如东洋51uh滤纸等。 （4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。,5.显色 为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。 (1) 显色剂显示：被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法。 (2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素b1、b2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。 6.定性分析 层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的rf值，就可以对物质进行定性。,7.定量分析 对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： (1) 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量。 (2) 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。 (3) 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。,第三节 凝胶层析 凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用混合液中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。,一、基本原理 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。,样品中各组分的流出顺序，可用分配系统ka来量度： ka=(ve-vo)/vi 式中ve：为洗脱体积(elution volume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积； vo：外体积(outer volume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积； vi：内体积(inner volume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。 当某组分的ka=0时(即ve=vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，分子完全排阻，洗脱时最先流出； 若某组分的ka=1(即ve=vo+vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，分子完全渗透，洗脱时，最后流出； ka在0-1之间的组分，洗脱时ka值小的先流出 ，ka值大的后流出。,在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于vo+vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即ka的最大值为1。然而在某种情况下ka值会大于1。这种反常现象说明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程。 对于同一类型的化合物而言，组分的洗脱体积ve与相对分子质量(mr)的关系可用下式表示： ve=k1- k2lgmr 式中k1，k2为常数。,若以组分的洗脱体积(ve)对组分相对分子质量的对数(lgmr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。在实际应用中多以相对洗脱体积kav (kav=ve/vt) 对lgmr作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子质量的组分应位于直线部分。若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验。,排阻极限 排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如sephadex g-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。,二、凝胶的分类及性质 凝胶的种类很多，其共同特点是内部具有微细的多孔网状结构，其孔径的大小与被分离物质的相对分子质量大小有相应的关系。常用的有：葡聚糖凝胶（sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）、琼脂糖凝胶（sepharose）以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。,1. 葡聚糖凝胶 由相对分子质量为4 104-20 104的葡聚糖交联聚合而成。它是葡聚糖与3氯1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。由pharmacia (ge)公司生产的商品名为sephadex的葡聚糖凝胶，具有良好的化学稳定性等优点，为最常用的凝胶之一。sephadex耐碱，在0.01mol/l盐酸中放置半年不受影响，故广泛用于各种物质的分离纯化。,sephadex有g10、g15、g25、g50、g75、g100、g150、g200等多种型号。后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml/g干胶）乘以10。如sephadex g-50，表示吸水率是5ml/g干胶。sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的sephadex的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。 g后面的数字越大，胶粒内的孔经越大，排阻极限越大，分离范围也越大，越适合于大分子的分离。同型号的sephadex，颗粒越细，在同样柱长的柱子中分辨力越好，但流速也越慢。 sephadex中排阻极限最大的g-200为6105。,sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。sephadex稳定工作的ph一般为为210。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免sephadex与强酸和氧化剂接触。sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒。 sephadex由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它可与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。,sephadex有各种颗粒大小（一般有粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。 另外，sephadex g-25和g-50中分别加入羟丙基基团反应，形成lh型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为sephadex lh-20和lh-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。,2. 聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成凝胶，由丙烯酰胺(ch3=ch-conh2)与甲叉双丙烯酰胺(ch3=ch-conh-ch2-nhco-ch=ch2)共聚而成。 商品名称为生物胶p(bio-ge1p)。主要型号有bio-gel p-2 bio-gel p-300等10种，后面的数字代表它们的排阻极限的103，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。 聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于sephadex。排阻极限最大的bio-gel p-300为4105。,聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在ph为110之间比较稳定。 但在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。另外，聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。,3. 琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶，可制成不带电荷的琼脂糖，用琼脂糖制成颗粒内孔径不等的多种型号层析用琼脂糖凝胶，商品为sepharose。sepharose的孔经大，机械强度好，层析时流速较快，但只能分离相对分子质量较大的分子。 近年pharmacia (ge)公司推出商品名为supersose的琼脂糖凝胶，主要有含琼脂糖6%的superose6 和含琼脂脂糖12%的superose12 及其衍生物。superose刚性特好，理化稳定性高，在高黏度液体(如8mol/l尿素)下能保持较好的流速，适合于糖类、核酸、病毒和包含体蛋白在促溶剂中的纯化。,琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两种凝胶。琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以030 c为宜。 sepharose与2,3二溴丙醇反应，形成sepharose cl型凝胶（cl-2b cl-4b），它们的分离特性基本没有改变，但热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更广泛的ph范围内应用，稳定工作的ph范围为313。,4.聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 商品名sephacryl，是由甲叉双丙烯酰胺交联丙烯葡聚糖形成的球形凝胶颗粒，其化学和机械稳定性较高。 sephacryl的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于sephadex的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。,sephacryl与sephadex相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液。耐高温，sephacryl稳定工作的ph一般为3-11。另外sephacryl的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以sephacryl相比sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。,5.聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶 这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由lkb提供，商品名为ultragel。这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺，所以有较高分辨率；而它又含有琼脂糖，这使得它又有较高的机械稳定性，可以使用较高的洗脱速度。可分离相对分子质量103-108 的蛋白质，亦可用于分离多糖和核酸。,6.琼脂糖和葡聚糖交联凝胶 pharmarcia公司提供的新型凝胶过滤介质，是将葡聚糖共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上制成的球形凝胶珠，商品名superdex。流速快、反压低、非特异性吸附很低，因而样品回收率很高，是目前分辨率和选择性最好的凝胶过滤介质。有多种型号可供选择，适合于生物大分子的精细纯化。,7.多孔硅胶、多孔玻璃珠 多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。这类凝胶属于硬质无机凝胶，它们的最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好，使用方便而且寿命长。 多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，所以柱效相对较低。它们的最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），可能会吸附比较多的蛋白。另外它们也不能用于强碱性溶液，一般使用时ph应小于8.5。,三、凝胶的选择、处理和保存 1. 凝胶的选择 不同类型的凝胶在性质以及分离范围上都有较大的差别，所以在进行凝胶层析实验时要根据样品的性质以及分离的要求选择合适的凝胶，这是影响凝胶层析效果好坏的一个关键因素。 一般来讲，选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围，根据分离范围来选择合适型号的凝胶。,选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重；颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。 选择时要依据分离的具体情况而定，例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。,2. 凝胶的处理 凝胶使用前要首先要进行处理。葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶干胶的处理首先是在水中膨化，不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。 一般吸水率较小的凝胶（即型号较小、排阻极限较小的凝胶）膨化时间较短，在20 条件下需34小时；但吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻极限较大的凝胶）膨化时间则较长，20条件下需十几个到几十个小时，如sephadex g-100以上的干胶膨化时间都要在72小时以上。,膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。 排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。,3. 凝胶的保存 凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02的叠氮化钠，4 下保存。 如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60 烘箱中烘干，即可装瓶保存。注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。,四、操作 1、层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。 层析柱一般内径1-4cm，柱长10-150cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:251:100之间。,2、操作 装柱方法同吸附柱层析。 加样方法同吸附柱层析，样品液浓度大些为好，但黏度不能过大，样品体积一般为柱体积的1%-10%。凝胶柱平衡和洗脱一般用同一种溶液，洗脱液无特殊要求，一般选择使样品稳定的缓冲液。 洗脱液的流速要稳定，分离蛋白质和核酸时，常用输液泵、柱、检测器、分部收集器、记录仪构成层析系统。,要通过实验合理调整流速、检测器和记录仪的灵敏度， 记录仪的走纸速度，才能获得良好的洗脱曲线。若峰有重叠，宜加长柱子，降低流速，若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快流速。峰过高，可减少加样量，或降低检测器和记录仪的灵敏度。峰过低则加大灵敏度，或加大加样量。 凝胶暂时不用时，可加少许防腐剂如0.02%叠氮钠或0.002%的洗必泰防止染菌。用过的凝胶可加热灭菌后低温保存或用20%左右的乙醇保存。,五、凝胶层析的应用 1. 生物大分子的纯化 凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶层析无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。,2. 分子量测定 在一定的范围内，各个组分的ve与其分子量的对数成线性关系。 ve=k1- k2lgmr 由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出ve对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的ve，通过标准曲线即可求出其分子量。 凝胶层析测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。,这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大； 上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶层析不能用于测定这类分子的分子量；,3、脱盐及去除小分子杂质 利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。,4、去热源物质 热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。 例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的方法。,5、溶液的浓缩 利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的sephadex（粗颗粒）加入溶液中，sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。 通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和ph值。,凝胶层析的优缺点 1. 凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。 2. 分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100。 3. 分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。,4. 应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如sephadex g类为102105d；sepharose类为105108d。 5. 分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。,第四节 亲和层析 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。,在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性，具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、dna和rna、激素和其受体、dna与结合蛋白等。 生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的层析方法称作亲和层析法。,亲和层析中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。,一、亲和层析原理 生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。,被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。,将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上； 其它不能与配体结合的杂质，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。 通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。,亲和色谱法的基本过程是： 1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱。 2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。,亲和层析的示意图,二、亲和吸附剂 选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等等。 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。配基必须偶联于不溶性母体(matrix) (又称基质或载体)上，常用的基质主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。,（一）基质的选择 基质构成固定相的骨架，亲和层析的基质应该具有以下一些性质： 1. 具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的ph、离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改变。 2. 能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变基质和配体的基本性质。,3. 基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与配体结合。所以一般来说，多选择较大孔径的基质，以使待分离物有充分的空间与配体结合。 4. 基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并与配体作用。,一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。 纤维素：价格低，可利用的活性基团较多；它对蛋白质等生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，稳定性和均一性也较差。,多孔玻璃珠：机械强度好，化学稳定性好；可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。 琼脂糖凝胶：基本可以较好的满足上述四个条件，它具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。琼脂糖凝胶微球的商品名为sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2b、4b、6b。,（二）基质的活化 基质的活化：是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。 琼脂糖多糖基的活化 多糖基质是琼脂糖的一种常用的基质。琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。,溴化氰活化 溴化氰与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯到基质上、生成亚胺碳酸活性基团，进而与配基偶联,可以和伯氨基（nh2）反应，主要生成异脲衍生物。 优点：溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大。,缺点：溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。,溴化氰活化与配基偶联化学反应式,2. 环氧乙烷基活化 这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基。 优点：活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的nc、oc和sc键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长；没有溴化氰的毒性；自动引入手臂。 缺点：用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，ph为9-13，这样的条件对于一些比较敏感的配体不适用。,环氧氯丙烷活化反应式,聚丙烯酰胺的活化 聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基，可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。 多孔玻璃珠的活化 对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺玻璃，在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进一步反应引入活性基团，与适当的配体偶联。,（三）间隔臂分子（“手臂”）的引入 在亲和层析中，由于配体结合在基质上，它在与待分离的生物大分子结合时，很大程度上要受到基质和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。尤其是当配体较小或待分离的生物大分子较大时，由于直接结合在基质上的小分子配体非常靠近基质，而待分离的生物大分子由于受到基质的空间障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体，影响了待分离的生物大分子与配体的结合，造成吸附量的降低。,解决这一问题的方法通常是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔臂”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应，大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。 加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。,引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基化合物nh2 (ch2)n r共价结合到活化的基质上，r通常是氨基或羧基，n一般为212。例如pharmacia公司生产的ahsepharose 4b和chsepharose 4b就是分别将1,6乙二胺，6氨基乙酸与cnbr活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。 引入间隔臂的基质与配体结合时，配体就可以离开基质一定的空间，从而可以减少空间位阻效应，易于与待分离物质结合。,手臂（spacer)化合物,乙二胺 nh2-ch2-ch2-nh2 已二胺