第7章_第2节_PCR技术(3_LMJ).ppt

基因操作,第七章,gene manipulating,2019年4月6日1时47分,1,第二节,pcr 技术的原理与应用 polymerase chain reaction,江黎明 2013年10月,2019年4月6日1时47分,2,pcr(polymerase chain reaction)技术是1985年由美国科学家kary b mullis发明的体外基因片段扩增的方法。,一、pcr技术的产生,2019年4月6日1时47分,3,pcr技术的创建,kary b. mullis（穆利斯（美）,1971年,khorana等提出在体外dna经变性,与适当引 物杂交后用dna聚合酶延伸,克隆dna的设想。,1983年,mullis发明了pcr技术。,1988年,saiki等将耐热dna聚合酶(taq)引入pcr技。,1989年,美国science杂志列pcr 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为pcr爆炸年。,1993年,mullis荣获度诺贝尔化学奖。,2019年4月6日1时47分,4,二、pcr技术的基本原理,dna模板变性 (denature)：,95左右高温使模板dna完全变性。,单链dna模板与引物退火 (annealing)：,55左右引物与模板形成复合物的几率dna分子自身的复性。,引物的延伸 (extension)：,72左右耐热dna聚合酶在最适温度下催化dna合成反应。,2019年4月6日1时47分,5,5,primer 1,5,primer 2,5,5,template dna,pcr技术的基本原理示意图,taq酶,taq酶,2019年4月6日1时47分,6,2019年4月6日1时47分,7,pcr体系的5种基本组成成分,2019年4月6日1时47分,8,pcr反应循环,变性 9395c左右,延伸 酶最适温度,退火 引物tm-5c,经过30个左右的循环后，模板dna的含量可以扩大100万倍以上。,2019年4月6日1时47分,9,思考题 1,pcr技术的主要特点,1.特异性强,2.灵敏度高,3.简便快速,4.对标本的纯度要求低,2019年4月6日1时47分,10,衡量pcr好坏的参数：,特异性specificity:最好只有目的dna带。,真实性fidelity:dna序列正确。,产量quantity:dna带明亮。,2019年4月6日1时47分,11,思考题 2,利用特异性引物以cdna或基因组dna为模 板获得已知目的基因片段。,利用简并引物从cdna文库或基因组文库中 获得具有一定同源性的基因片段。,利用随机引物从cdna文库或基因组文库中 随机克隆基因。,用不同引物进行pcr获取目的基因：,三、pcr技术的主要用途及其衍生技术,（一）目的基因的克隆,2019年4月6日1时47分,12,(reverse transcription pcr,rt-pcr),1.反转录pcr技术,特点：敏感度高、特异性强、省时等。,rt-pcr是从组织细胞中获得目的基因、对已知 序列rna进行定性及半定量分析最的有效方法。,总rna (或mrna),ss-cdna,ds-cdna,pcr扩增,2019年4月6日1时47分,13,获取目的基因的特殊pcr技术：,rt-pcr原理,aana,ttnt 5,5,mrna,反转录酶,mrna,cdna,3,ttnt,aana,核糖核酸酶h,ttnt,3,dna poly i,cdna,核酸酶s1,双链cdna,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,dna聚合酶,pcr,大量的产物,2019年4月6日1时47分,14,rt-pcr的结果举例,2019年4月6日1时47分,15,gt10/11系列 (插入型，适用于cdna克隆),4/6/2019 1:47 pm,16,重组噬菌体,锚定pcr,末端核酸转移酶,先合成第一链cdna后,添加一同聚物尾(polydg),与带有polydc 限制性内切位点的3锚定引物一起扩增。,2019年4月6日1时47分,17,原理：,设计“内、外” 两对引物：,2.巢式-pcr（nested-pcr）,先用外引物进行pcr反应，从模板上扩增出含有内引物扩增的靶序列的较长产物，并以此作为模板用内引物进行第二次pcr反应，扩增出内侧的较短靶序列。,外引物对应的序列在模板的外侧； 内引物对应的序列在外引物的内侧。,2019年4月6日1时47分,18,第1轮pcr：1520个循环的标准扩增。,第2轮pcr：将第1轮pcr扩增产物稀释1001000倍， 作为模板进行第2轮pcr ，扩增1520个循环。,2019年4月6日1时47分,19,降低了多个靶位点扩增的可能性，因与2套引物都互补的靶序列很少。如用相同引物对作总数相同的循环，会扩增非特异性靶点。,可增加有限量靶序列(如稀有mrna)的灵敏度，并且提高了困难pcr(如5 race)的特异性。,用外、内2对引物扩增，可大大提高扩增的灵敏度和特异性。,2019年4月6日1时47分,20,3.cdna末端快速扩增,2019年4月6日1时47分,21,3-race,2019年4月6日1时47分,22,5-race,5-cap,aaaaaaaaaa3,mrna,gsp1,1.逆转录,去除rna和gsp1,2.末端转移酶,3ccccc,3ccccc,3.退火，pcr,gsp2,5gactcgagtcgacatcgaggggg-3,xho l sal i clai,3. pcr,用限制性内切酶切割克隆即获得5末端片段,2019年4月6日1时47分,23,2019年4月6日1时47分,24,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,4.反向pcr (reverse pcr),用反向的互补引物来扩增两引物以外的dna片段对某个已知dna片段两侧的未知序列进行扩增。,2019年4月6日1时47分,25,电泳,*2，3双脱氧核苷酸,*用4种不同荧光标记,dna样品 引物、dna聚合酶、dntp,a,a,c,g,t,g,g,a,c,t,末端合成终止法测定dna序列的原理,dna自动测序结果,2019年4月6日1时47分,27,the nobel prize in chemistry 1980,“for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-dna“,“for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids“,paul berg,1/2 of the prize,stanford university stanford, ca, usa,1926 -,walter gilbert frederick sanger,1/4 of the prize 1/4 of the prize,harvard university, biological laboratories cambridge, ma, usa,mrc laboratory of molecular biology cambridge, united kingdom,1932 -,1918 -,2019年4月6日1时47分,28,（二）基因的体外突变,利用pcr技术可以随意设计引物在体外进行基因的嵌和、缺失、点突变等改造。,利用pcr技术构建重组体和突变体的方法称为重组pcr(recombinant pcr)。,特点是简单、省时；利用两对引物很容易的在dna片段的任何位置进行点突变。,2019年4月6日1时47分,29,1. 随机突变：,应用：,策略：易错pcr（error-prone pcr）。,利用taq dna聚合酶等没有35校对功能的特性，在pcr扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，产生随机错误的扩增产物。,加入itp并限制某一种核苷酸用量，从而促进dna聚合酶选择其它3种核苷酸或itp，导致产物发生突变。,构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体,2019年4月6日1时47分,30,2.定点点突变,(1) 5端引入点突变：,(2) 序列中的点突变：,通过修饰上游引物的5端的碱基序列，可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。,采用重叠延伸pcr(overlap extension pcr，oe pcr。,2019年4月6日1时47分,31,用酶a和b消化、克隆，将突变位点引入pcr重组体。,(1) 末端引入点突变,2019年4月6日1时47分,32,ecori,hindiii,digest, subclone sequence,pvuii,(2) 序列中的点突变：,2019年4月6日1时47分,33,例子：s.pn的ply146aa缺失的突变序列构建,肺炎链球菌s.pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：,首先设计4个引物：(m1和m2完全重叠),p1: 5-cgggatccatggcaaataaagcagtaaatg-3 bamh i,p2: 5-ccgctcgagcaagcattctcctctcctagtc-3 xho i,m1: 5-ggtcaataatgtccca-agaatgcagtatg-3,m2: 5-catactgcattct-tgggacattattgacc-3,2019年4月6日1时47分,34,以基因组dna为模板，以p1和m1为引物扩增出ply上游片断，以p2和m2为引物扩增出ply下游片断；,2.以上下游片断为模板，以p1和p2为引物扩出全长；,3.酶切后克隆到质粒中保存。,2019年4月6日1时47分,35,a,b,3.引入大片段缺失,2019年4月6日1时47分,36,4.多位点突变,策略：多次重叠pcr,关键：重叠引物设计(每对均需部分重叠，方向相反)。,2019年4月6日1时47分,37,基本操作,2019年4月6日1时47分,38,（三）dna的微量分析,pcr技术敏感度很高，理论上只要存在1分子的模板，就可以获得目的片段，是dna微量分析的最好方法。,实际工作中，1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足pcr的检测需要。,2019年4月6日1时47分,39,（四）mrna的含量分析,用于rna检测的常用字方法有原位杂交、点杂交、northern印迹杂交及核酸酶保护试验等，都难以检测低丰度的mrna，且操作繁琐。,在敏感性方面，rt- pcr用于mrna定量分析要远高于上述传统方法。,rt-pcr用于mrna定量分析面临的问题：,在第一步合成cdna的反应中会造成一些误差，但是更重要和显著的误差是由pcr反应本身造成。,2019年4月6日1时47分,40,用于定量pcr分析的两种技术：,竞争性定量pcr：,在反应前加入外源标准品rna作为内参照；须使用与样品rna同样的引物识别序列，但产物的大小不同，以在电泳时区别开。,属反应终点分析方法，需用系列稀释标准rna做成标准曲线，样品rna的含量应在标准曲线范围内。,实时pcr(real time pcr)：,是近年发展起来的一种rna微量分析技术；精确度高，结果明确，操作容易，能进行高通量检测。,2019年4月6日1时47分,41,实时pcr的基本原理,在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。,不同公司的仪器和反应系统所用的荧光报告系统不同：,molecular probe 公司的sybr green 系统,perkin-elmer/abd公司的taqman系统,invitrogen公司的molecular beacons系统,2019年4月6日1时47分,42,原理:,pcr扩增时，taq酶的5- 3外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光； 每扩增一条dna链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。,2019年4月6日1时47分,43,思考题 3,1.实时荧光pcrtaqman技术,实时荧光pcrtaqman技术,2019年4月6日1时47分,44,taqman技术的优、缺点,优点：杂交效率高,2019年4月6日1时47分,45,x,2.实时荧光pcr分子信标技术,2019年4月6日1时47分,46,分子信标技术的优、缺点,2019年4月6日1时47分,47,sybr green i是一种只与双链dna小沟结合的染料，当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。,因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna的量。,3.实时荧光pcrsybr green i 技术,2019年4月6日1时47分,48,sybr green i荧光染料的作用原理,2019年4月6日1时47分,49,sybr green i 技术的优、缺点,2019年4月6日1时47分,50,荧光曲线,随着pcr反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图,4.实时定量pcr的定量原理,2019年4月6日1时47分,51,荧光阈值,在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即pcr扩增产物量的标准)。,阈值线,实时定量pcr的两个重要概念,2019年4月6日1时47分,52,ct值的概念,ct值的定义是pcr扩增过程中，扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩