显微镜成像方法与技术-1.ppt

显微成像方法与技术,第一讲、显微镜的发展简史和分类,显微镜的发展简史,早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。 1590年，荷兰眼镜商zaccharias jansen和他的儿子以及意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器，放大200倍左右。 1604年，jansen创造地球上第一台显微镜。 1611年，kepler(克卜勒) ：提议复合式显微镜的制作方式。,1665年，胡克（hooke robert ，1635-1703）发表了显微图集一书，这是在他全部成就中最重要的一部著作，也是欧洲17世纪最主要的科学文献之一。他开始应用显微镜于生物研究，他将蜜蜂的刺、苍蝇的脚、鸟的羽毛、鱼鳞片以及跳蚤、蜘蛛、草麻等，用显微镜详细地予以考察比较。他观察到软木塞等物品的结缔组织，并使用“细孔”和“细胞”来说明，“细胞”（“cell”）一词从此被生物界直接采用。胡克的这一发现，引起了人们对细胞学的研究。现在知道，一切生物都是由无数的细胞所组成的。胡克对细胞学的发展作出了极大的贡献。,单式镜,列文虎克设计的显微镜,列文虎克用他的显微镜 观察细菌的记录,列文虎克关于甲壳虫眼睛的 一封信中的插图,用列文虎克制作的显微镜 观察到的人血涂片,1674年，leeuwenhoek(列文虎克)：发现原生动物学的报导问世，并于九年后成为首位发现细菌存在的人。 荷兰人安东尼冯列文虎克（anthony von leeuwenhoek ，1632-1723）制造的显微镜让人们大开眼界。列文虎克自幼学习磨制眼镜片的技术，热衷于制造显微镜。他制造的显微镜其实就是一片凸透镜，而不是复合式显微镜。不过，由于他的技艺精湛，磨制的单片显微镜的放大倍数将近300倍，超过了以往任何一种显微镜。,1830年，英国外科医生李斯特改良了球面晶片所映的影像不清的问题，制作出日后复式显微镜（ compound microscope ）的原型。 1833年，brown(布朗)：在显微镜下观察紫罗兰，随后发表他对细胞核的详细论述。 1838年，schlieden and schwann(施莱登和施旺)：皆提倡细胞学原理，其主旨即为有核细胞是所有动植物的组织及功能之基本元素。 1857年，kolliker(寇利克)：发现肌肉细胞中之线粒体。 1872年，德国数学及物理学家阿贝提出阿贝正弦条件（ abbe sine condition ） ，从而令显微镜在设计过程中能达到最高清晰度。 1876年，abbe(阿贝)：剖析影像在显微镜中成像时所产生的绕射作用，试图设计出最理想的显微镜。 1879年，flrmming(佛莱明)：发现了当动物细胞在进行有丝分裂时，其染色体的活动是清晰可见的。 1881年，retziue(芮祖)：动物组织报告问世，此项发表在当世尚无人能凌驾逾越。然而在20年后，却有以cajal(卡嘉尔)为首的一群组织学家发展出显微镜染色观察法，此举为日后的显微解剖学立下了基础。 1882年，koch(寇克)：利用苯安染料将微生物组织进行染色，由此他发现了霍乱及结核杆菌。往后20年间，其它的细菌学家，像是klebs 和 pasteur(克莱柏和帕斯特)则是藉由显微镜下检视染色药品而证实许多疾病的病因。,1886年，zeiss(蔡氏)：打破一般可见光理论上的极限，他的发明-阿比式及其它一系列的镜头为显微学者另辟一新的解像天地。 1898年，golgi(高尔基)：首位发现细菌中高尔基体的显微学家。他将细胞用硝酸银染色而成就了人类细胞研究上的一大步。 1924年，lacassagne(兰卡辛)：与其实验工作伙伴共同发展出放射线照相法，这项发明便是利用放射性钋元素来探查生物标本。 1930年，lebedeff(莱比戴卫)：设计并搭配第一架干涉显微镜。另外由zernike(卓尼柯)在1932年发明出相位差显微镜，两人将传统光学显微镜延伸发展出来的相位差观察使生物学家得以观察染色活细胞上的种种细节。 1933年，德国电子工程师恩斯特 魯斯卡制作出全球第一部 电子显微镜（ electronic microscope）并于 1986 年获得诺贝尔物理奖。对科学界迈进原子层面有著不可或缺的地位。 1938年，德国工程师max knoll和ernst ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（tem）。这种显微镜是通过发射电子穿过极薄的标本切片来成像的。对于观察细胞的内部结构非常有用，tem能把标本放大50万倍。 1941年，coons(昆氏)：将抗体加上萤光染剂用以侦测细胞抗原。 1952年，nomarski(诺马斯基)：发明干涉相位差光学系统。此项发明不仅享有专利权并以发明者本人命名之。,1952年，英国工程师charles oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（sem）。 1953年，德国物理学家zernike(卓尼柯)发明的相位差显微镜（ phase-contrast microscope），获得 1953 年诺贝尔物理奖。 1965年，第一台商用的扫描电子显微镜（sem）问世了。它把电子束发射到标本的表面（而不是穿过标本），然后形成标本外观的精细三维图像。sem能把标本放大15万倍。 1981年，allen and inoue(艾伦及艾纽)：将光学显微原理上的影像增强对比，发展趋于完美境界。 1981瑞士人g. binnig和h. roheri在ibm苏黎世实验中心（zurich research center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。 1988年，confocal(共轭焦)扫描显微镜在市场上被广为使用。,伽利略显微镜,1933年制作的电镜,1945年porter（细胞学之父）获得的细胞电镜照片,显微镜的分类,根据显微原理的不同，可分为光学显微镜、电子显微镜和扫描探针显微镜三大类。 光学显微镜的种类很多，主要有明视野显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、体视显微镜。 电子显微镜包括透射电镜tem和扫描电镜sem。 扫描探针显微镜包括：扫描隧道显微镜stm和扫描力显微镜sfm。扫描力显微镜sfm包括：原子力显微镜afm、摩擦力显微镜lfm、磁力显微镜mfm、静电力显微镜efm和化学力显微镜cfm。,各类显微镜的特点,光学显微镜通常皆由光学部分、照明部分和机械部分组成。无疑光学部分是最为关键的，它由目镜和物镜组成。光学显微镜以紫外和可见光为光源，现在的光学显微镜可把物体放大2000倍，分辨的最小极限达0.2微米。 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是电子显微镜用电子束作光源，用电磁场作透镜。电子显微镜由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 20世纪70年代，透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米)，现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子点阵。 扫描探针显微镜不用任何电子光学系统，仅用一个微小的针尖在样品附近进行扫描，测定其隧道电流或相互作用力等就可得到显微图像，扫描探针显微镜在结构上比电镜简单得多但能得到原子级空间分辨率（横向分辨率0.1nm，纵向分辨率优于0.01nm），不使用自由粒子，无需有透镜和专门的电子源，能在近天然的条件下对单个生物大分子进行直接观察。,第二讲、光学显微镜介绍,光学显微镜的基本结构,普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 机械部分 （1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 （2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 （3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。,（4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 （5）物镜转换器(旋转器)：接于镜筒的下方，可自由转动，盘上有34个圆孔，是安装物镜的部位。转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。转换物镜后，不允许使用粗调节器，只能用细调节器，使像清晰。,（6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔。 （7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。,粗调节器(粗准焦螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大幅度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。 细调节器(细准焦螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。,照明部分 装在镜台下方，包括反光镜和集光器。 （1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上 ，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 （2）集光器(聚光器)：位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。 聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。 光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。,光学部分 （1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有23个，上面刻有5、10或15符号以表示其放大倍数，一般装的是10的目镜。 （2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有34个物镜，其中最短的刻有“10”符号的为低倍镜，较长的刻有“40”符号的为高倍镜，最长的刻有“100”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10，目镜为10，其放大倍数就为1010=100。 显微镜目镜长度与放大倍数呈负相关，物镜长度与放大倍数呈正相关。即目镜长度越长，放大倍数越低；物镜长度越长，放大倍数越高。,光学显微镜的成像原理,物体通过物镜成倒立、放大的实像，该实像又通过目镜成正立、放大的虚像。,显微镜常用的照明方式,1、透射光照明：光线穿透被观察物体，射入物镜进行光学成像。生物显微镜照明都是透射光照明。例如：观察生物切片及一些透明物体或观察物体的轮廓用透射光。透射光还有一特点是：以工作台来划分为界，物镜与光源分别在工作台的上下两边。 2、反射光照明：物镜与光源在工作台的同一侧。光线自上而下照射被观物上再反射进入物镜进行光学成像。大多数体视镜为反射光照明。观察物体为非透明，要求放大倍率小。 3、同轴光照明：光线通过透镜组，由物镜口光线垂直射出，再反射回物镜里进行光线成像。金相显微镜，荧光显微镜就是同轴光照明。 特点：观察物体非透明，放大倍率要求较大（40倍以上）。观察物体表面反光很强或透明物体或有深度的物体，一般用同轴光，如观察液晶常常使用到。 4、暗场照明：光线不需直接照射观察物体，光照射方向被遮挡后四周围通过漫反射而产生。如暗视野显微镜。,透射光照明方式,反射光照明方式,同轴光照明方式,暗视野照明方式,聚光照明系统对显微观察的影响,聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响但又易于被使用者忽视的环节。它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明。 聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角，否则就不能充分利用物镜所能达到的最高分辨率。为此目的，在聚光镜中设有类似照相物镜中的可以调节开孔大小的可变孔径光阑，用来调节照明光束孔径，以与物镜孔径角匹配。观察高反差物体时，宜使照明光束充满物镜的全孔径；对于低反差物体,宜使照明光束充满物镜的2/3孔径。 在较完善的柯勒照明系统中，除可变孔径光阑外，还装有控制被照明视场大小的可变视场光阑，以保证被照明的物面范围与物镜所需的视场匹配。物面被照明的范围太小固然不行，过大则不仅多余，甚至有害，因为有效视场以外的多余的光线会在光学零件表面和镜筒内壁多次反射，最后作为杂散光到达像面，使图像的反差下降。,(1)调出清晰的多边形：将视场光阑和孔径光阑调到最小的状态，如果显微镜的状态正确，此时在视野中应该可以看到一个边缘清楚的多边形。如果看到的不是一个边缘清楚的多边形，则说明光路中的聚光镜上下位置不准确。此时转动聚光镜的上下调节旋钮，使聚光镜缓慢上升或下降，使得视场中形成一个边缘清晰的多边形。 (2)多边形调到正中心：视野中的多边形的正确位置应该是在视野的正中心，如果不在说明光路有偏移，需要调节聚光器对中螺钉，即两个银色的旋钮，使多边形在视野的中心。 (3) 多边形调成外切：将视场光阑慢慢放大，当多边形正好外切于视场的时候就是视场光阑的最佳工作位置。这样聚光器的光轴调到了与照明光路以及成像光路的光轴合轴。调节好后，日常使用中不要乱调对中螺丝杆！,聚光器的调节,(4) 调节聚光器的数值孔径，使其与物镜的数值孔径相配合，以取得最佳的分辨率。数值孔径与分辨率有密切关系，所以聚光器的数值孔径与物镜的数值孔径要相匹配。例如：低数值孔径的物镜要配合低数值孔径的聚光镜，反之高数值孔径的油镜要配合高数值孔径的聚光器。这样才能提高图象的分辨率。 孔径光阑的调节：研究用显微镜的聚光器的外侧边缘上均具有刻数及定位记号，便于调节聚光器与物镜的数值孔径相匹配。但有的聚光器外侧没有标刻数字，这样先将物镜聚焦，再取下一个目镜，眼睛往镜筒内看，可见物镜后透镜呈一明亮的圆，如看不见孔径光阑的轮廓象，说明开得过大；若仅是一个很小的明亮轮廓象，则说明缩得过小，当缓慢增大刚好与物镜后透镜呈一明亮圆时，则聚光镜与该物镜的数值孔径已相互匹配。,柯勒照明系统,照明系统一般有临界照明和柯勒照明两种。 光源经过聚光镜后，成像于物平面上的照明方式称为临界照明。若忽略光能的损失，则光源像亮度与光源本身相同。因此，这种照明方式相当于在物平面上放置光源，所以有结构简单、光能利用率高的优点；其缺点是，如果光源表面亮度不均匀，或明显地表现出细小的结构，如灯丝等，则会使物体表面照度不均匀，从而使接受器上的光能量分布不均匀，而影响成像质量和测量精度。 柯勒照明是将光源成像在物镜的入射光瞳处。柯勒照明必须满足以下成像关系。光源1经辅助聚光镜2成像在光阑4处；辅助聚光镜2经聚光镜5成像于物平面6上；聚光镜5把它焦点处的光阑4成像于无限远，与成像物镜的入瞳重合（设物镜的入瞳位于无限远）。由于柯勒照明不是直接把光源，而是把被光源均匀照明了的辅助聚光镜2 （也称为柯勒镜）成像在物平面上，因此，柯勒照明的优点是可以使物体得到均匀的照明，克服了临界照明中物平面照明不均匀的缺点。柯勒照明的缺点是这种照明系统结构复杂，光能损失较大。,柯勒是十九世纪末蔡司厂的工程师，为了纪念他在光学领域的突出贡献，后人把他发明的二次成像叫做柯勒照明。柯勒照明克服了临界照明的缺点，是研究用显微镜中的理想照明法。这种照明法不仅观察效果佳，而且是成功地进行显微照相所必须的一种照明法。,聚光器的数值孔径,光源,白炽灯：利用热辐射原理而实现的。最简单的白炽灯就是给钨灯丝导通足够的电流，灯丝发热至白炽状态，就会发出光亮，但这种白炽灯的寿命会相当的短。 卤素灯（卤钨灯）：卤素灯与白炽灯的最大差别在于一点，就是卤素灯的玻璃外壳中充有一些卤族元素气体（通常是碘或溴）。工作原理：当灯丝发热时，钨原子被蒸发后向玻璃管壁方向移动，当接近玻璃管壁时，钨蒸气被冷却到大约800并和卤素原子结合在一起，形成卤化钨（碘化钨或溴化钨）。卤化钨向玻璃管中央继续移动，又重新回到被氧化的灯丝上，由于卤化钨是一种很不稳定的化合物，其遇热后又会重新分解成卤素蒸气和钨，这样钨又在灯丝上沉积下来，弥补被蒸发掉的部分。通过这种再生循环过程，灯丝的使用寿命不仅得到了大大延长（几乎是白炽灯的4倍），同时由于灯丝可以工作在更高温度下，从而得到了更高的亮度，更高的色温和更高的发光效率。,由于卤素灯泡需要工作在更高的温度下，普通玻璃外壳在此温度下会熔化并产生流动。熔凝石英玻璃（fused quartz）由于具有极低的热膨胀系数，因而代替普通玻璃应用在卤素灯泡中。由于普通玻璃可以隔断紫外线，但石英玻璃不能，所以卤素灯泡会发射出具有紫外光波段的不可见光。,欧司朗(osram ) 12v 100w 卤素灯,物镜,位于被观察物体附近实现第一级放大的镜头。一般由8 10片透镜组成 。物镜放大倍率通常为5100倍 。多个物镜共同镶在物镜转换器(旋转器)上，可以按需要转动转盘选择不同倍数的物镜。物方视场直径（即通过显微镜能看到的图像范围）约为 11-20毫米。物镜放大倍率越高则视场越小。 物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件。常用的有：(1)消色差物镜(achromat) 色差校正使可见光中红光和蓝光聚焦于一点，而黄绿光则聚焦于另一点。能够消除光谱中红光和蓝光所形成的色差。这种物镜与目镜配用时可达到消色差物镜所要求的光学性能。(2)复消色差物镜(apochromat)是性能最高的物镜。能消除可视光中黄、红、蓝即包括几乎所有谱线在成像过程中所造成的色差。(3)平象物镜它们所成的影象基本上是平的，象场弯曲很小，不会发生视野中心与边缘不能同时准焦的现象，因此对目视观察及显微摄影都极为方便。平象物镜由于将弯曲的影象展平，在同样放大倍数下它成的影象比用一般物镜要大一点。在平象物镜的金属外框上，刻有flanachr、planapo、plan等字样。,像差,球差,象散,慧差,场曲,负畸变,正畸变,色差,球差校正,色差校正,目镜,位于人眼附近实现第二级放大的镜头。一般由两个凸透镜构成，它除了进一步扩大物镜所形成的实像之外，也限制了眼睛所观察的视野 。目镜放大倍率通常为520倍，按能否放置分划板可分成两类：不宜放置分划板的，如惠更斯型目镜。这是现代显微镜中常用的型式，优点是结构简单、价格低廉；缺点是由于成像质量的原因，不宜放置供瞄准定位或尺寸测量用的分划板。能放置分划板的，如凯尔纳型和对称型目镜，它们能克服上述目镜的缺点。按照能看到的视场大小，目镜又分为视场较小的普通目镜和视场较大的大视场目镜（或称广角目镜）两类。,惠更斯目镜是由两片未经过色差校正的凸透镜组成；靠近眼睛的一片称为目透镜，起放大作用；另一片称为场透镜，它的作用使映像亮度均匀。在两块透镜之间的目透镜焦平面放一光栏，把显微刻度尺放在此光栏上，从目镜中观察到迭加在物象上的刻度。 惠更斯目镜既可用于观察，又可用于照相。当物镜所成的像在目透镜焦点之内时成放大虚像，可以进行显微观察；当物镜所成的像在目透镜焦点之外时成放大实像，可进行显微摄影。惠更斯目镜因焦点在两片透镜之间，故不能单独作为放大镜使用。这种不能单独作为放大镜用的目镜叫做负型目镜。惠更斯目镜没有校正像差，只适合与低、中倍消色差物镜配合使用，它的放大倍数一般不超过15倍。,视场数,视场数定义为目镜的视场光阑的直径（以mm为单位）。 通过目镜能够观察到的物体表面实际视场(field of view, f.o.v.)由以下公式计算 f.o.v.=目镜视场数 / 物镜倍率（mm) 例如，蔡司的10x目镜视场数是23，当使用40x的物镜时，实际视场大小为23/40=0.575mm。 视场数与目镜的放大倍数一起标示在目镜镜筒上，如蔡司10x目镜上标示有10x/23，23即视场数。尼康10x目镜上标示有10x/22，即视场数为22。,显微镜的分辨率 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为： r=0.61 /na nasin/2 式中：n=介质折射率；=镜口角（标本对物镜镜口的张角），n.a.=镜口率（数值孔径，numerical aperture）。镜口角总是要小于180，所以sin/2的最大值必然小于1。,数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短，na越大，分辨率越高。同样的倍数的物镜,数值孔径越大,则光通亮越大,分辨率越高。,数值孔径是显微物镜的一个重要性能指标，通常与放大倍率一起标注在物镜镜筒外壳上，例如40/0.65表示物镜的放大倍率为40倍，数值孔径为0.65。数值孔径反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高。 蔡司各物镜的镜口率如下： 物镜 镜口率(n.a.) 工作距离(mm) 10 0.30 5.60 20 0.40 1.50 40（oil） 1.30 0.21 63（water） 1.20 0.24 100（oil） 1.40/1.45 0.17/0.11,点光源经过光学仪器的小圆影响，所成的像不是一个点，而是一个明暗相间的衍射图样，中央为爱里斑。,瑞利判据：当一个点光源的衍射图样的中央最亮处刚好与另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹相重合时，这两个点光源恰好能被分辨。,制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2m，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000x。,一些介质的折射率,工作距离：指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。一般情况下，物镜的数值孔径越大，其工作距离越小。,焦点深度：显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的上下两侧也能看清楚，两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。,焦点深度计算公式： d= k / m n.a. 其中，k为常数240微米， ：被检物体周围的折射率 m：总放大率 n.a.：物镜的数值孔径,（一）明视野显微镜,明视野显微镜（bright-field microscope） 是最通用的一种光学显微镜。利用光线照明，标本中各点依其光吸收的不同在明亮的背景中成像。它由物镜、目镜、聚光镜、光源、载物台和支架等部件组成。其中聚光镜用于调节显微镜的照明，物镜和目镜是放大微小物体成像的主要部件。由同轴的两个正透镜物镜和目镜组成的显微镜称为复式显微镜。未经染色处理的生物标本，由于对光线的吸收很少，造成反差低的影像，不利于明视野显微镜观察。使用染料对生物标本染色后增加了反差，成为明视野显微镜的主要观察对象。 在明视野显微镜中，最有代表性的就是生物显微镜， 当然，除了明视野，生物显微镜还有暗视野。暗视野显微镜在实际应用中，比明视野显微镜要少得多。,（二）暗视野显微镜,暗视野显微镜（dark-field microscope）的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本散射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。暗视野显微镜虽然不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨0.004m以上的微粒的存在和运动，分辨率比普通光学显微镜高50倍。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。,丁达尔效应 暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”，这种现象即丁达尔效应。暗视野显微镜由于不将照明光直接射入观察系统，无物体时，视野暗黑，不可能观察到任何物体；当有物体时，以物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中明亮可见。,树林中的丁达尔现象,金纳米哑铃的穿透式电子显微镜图片： (a)明视野影像(b)暗视野影像,暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。这些样品因为具有和周围环境相似的折射率，不易在一般明视野之下看的清楚，于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。这种显微镜能见到小至4200nm的微粒子，只能看到物体的存在、运动和表面特征，不能辨清物体的细微结构。,（三）相差显微镜,相差显微镜（phase-contrast microscope，pcm）最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 当光线透射透明的、折射率与周围介质折射率不同的物体时，其相位会发生变化，而振幅（明、暗差别）和波长（颜色）的变化不明显，因此无法被人的眼睛识别。相差显微镜，则是依靠装在物镜内的相位板，使照射物体点的直射光与衍射光发生干涉，使相位差转换成振幅差（明暗差别），从而使人们可以观察无色透明的标本。,相差显微镜的基本原理 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位（指在某一时间上光的波动所能达到的位置）的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。,在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1.环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。 2.相位板（annular phase-plate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。相位板安装在物镜的后焦面处，相位板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。,相差显微镜照明原理,一种介壳虫的染色体（pcm照片）,（四）偏光显微镜,偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：在光源与被检物体之间装有起偏器，使进入显微镜的光线为偏振光，在物镜与目镜之间装有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。,光的偏振现象 光波根据振动的特点，可分为自然光与偏振光。自然光的振动特点是在垂直光波传导轴上，各平面上振动的振幅分布相同；自然光经过反射、折射、双折射及吸收等作用，可得到只在一个方向上振动的光波，这种光波则称为“偏光”或“偏振光”。 自然光经过偏振片后，改变成为具有一定振动方向的光。这是由于偏振片中存在着某种特征性的方向，叫做偏振化方向，偏振片只允许平行于偏振化方向的振动通过，同时吸收垂直于该方向振动的光。通过偏振片的透射光，它的振动限制在某一振动方向上，我们把第一个偏振片p1叫做“起偏器”，它的作用是把自然光变成偏振光，但是人的眼睛不能辨别偏振光，必须依靠第二片偏振片p2去检查。旋转p2，当它的偏振化方向与偏振光的偏振面平行时，偏振光可顺利通过，这时在p2的后面有较亮的光。当p2的偏振方向与偏振光的偏振面垂直时，偏振光不能通过，在p2后面也变暗。第二个偏振片帮助我们辨别出偏振光，因此它也称为“检偏器”。,偏光的产生及其作用 偏光显微镜最重要的部件是偏光装置起偏器和检偏器。过去两者均为尼科尔(nicola)棱镜组成，它是由天然的方解石制作而成，但由于受到晶体体积的限制，难以取得较大面积的偏振，近来偏光显微镜则采用人造偏振镜来代替尼科尔梭镜。 人造偏振镜是以硫酸喹啉又名herapathit的晶体制作而成，呈绿橄榄色。当普通光通过它后，就能获得只在一直线上振动的直线偏振光。 偏光显微镜有两个偏振镜，一个装置在光源与被检物体之间的叫“起偏镜”；另一个装置在物镜与目镜之间的叫“检偏镜”。 从光源射出的光线通过两个偏振镜时，如果起偏镜与检偏镜的振动方向互相平行，即处于“平行检偏位”的情况下，则视场最为明亮。反之，若两者互相垂直，即处于“正交检偏位”的情况下，则视场完全黑暗，如果两者倾斜，则视场表明出中等程度的亮度。由此可知，起偏镜所形成的直线偏振光，如其振动方向与检偏镜的振动方向平行，则能完全通过；如果偏斜，则只以通过一部分；如若垂直，则完全不能通过。因此，在采用偏光显微镜检时，原则上要使起偏镜与检偏镜处于正交检偏位的状态下进行。,单折射性与双折射性 光线通过某一物质时，如光的性质和进路不因照射方向而改变，这种物质在光学上就具有“各向同性”，又称单折射体，如普通气体、液体以及非结晶性固体；若光线通过另一物质时，光的速度、折射率、吸收性和偏振、振幅等因照射方向而有不同，这种物质在光学上则具有“各向异性”，又称双折射体，如晶体、纤维等。 双折射性是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域。在生物学中，很多结构也具有双折射性，这就需要利用偏光显微镜加以区分。在植物学方面，如鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、细胞壁以及细胞质与组织中是否含有晶体等。在植物病理上，病菌的入侵，常引起组织内化学性质的改变，可以偏光显微术进行鉴别。在人体及动物学方面，常利用偏光显微术来鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。,正交检偏位下的双折射体 在正交的情况下，视场是黑暗的，如果被检物体在光学上表现为各向同性（单折射体），无论怎样旋转载物台，视场仍为黑暗，这是因为起偏镜所形成的线偏振光的振动方向不发生变化，仍然与检偏镜的振动方向互相垂直的缘故。若被检物体具有双折射特性或 含有具双折射特性的物质，则具双折射特性的地方视场变亮，这是因为从起偏镜射出的直线偏振光进入双折射体后，产生振动方向不同的两种直线偏振光，当这两种光通过检偏镜时，由于另一束光并不与检偏镜偏振方向正交，可透过检偏镜，就能使人眼看到明亮的象。光线通过双折射体时，所形成两种偏振光的振动方向，依物体的种类而有不同。 双折射体在正交情况下，旋转载物台时，双折射体的象在360的旋转中有四次明暗变化，每隔90变暗一次。变暗的位置是双折射体的两个振动方向与两个偏振镜的振动方向相一致的位置，称为“消光位置”从消光位置旋转45，被检物体变为最亮，这就是“对角位置”，这是因为偏离45时，偏振光到达该物体时，分解出部分光线可以通过检偏镜，故而明亮。根据上述基本原理，利用偏光显微术就可能判断各向同性（单折射体）和各向异性（双折射体）物质。,（五）微分干涉差显微镜,1952年，nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope，dicm）。dic显微镜又称nomarski相差显微镜（nomarki contrast microscope），其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,dic显微镜的物理原理 dic利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、dic棱镜、dic滑行器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英wollaston棱镜，即dic棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个wollaston棱镜，即dic滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜dic影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节dic滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节dic滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。,诺马尔斯基dic 显微镜的简单原理 光线穿过特殊媒介（例如，水 ）中带有不同折射率的物质（例如，细胞）时，会产生相差。诺马尔斯基dic 利用这种相差增强反差。来自显微镜光源的光的波动方向与起偏器（聚光镜侧）的光一致，当其通过聚光镜侧的dic 棱镜时，就分为直角正交的两个光束。分裂距离称做裂劈间隙。当这两束光线通过带有不同折射率（例如，细胞）的媒介时，其中一束会发生延迟；而这两束光被dic 滑板（观察筒侧）和检偏镜重组时，干涉效应就会产生反差。这就是诺马尔斯基dic 的原理。,dic显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。,dic显微镜下的硅藻（伪彩色）,细胞的dic图像,（六）荧光显微镜,荧光显微镜是利用一个高发光效率的光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光365nm或紫蓝光420nm）作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。,尼康e-600显微镜,荧光的产生,一般情况下，原子和分子总是处于能量最低的状态（即基态）。在一定条件下，原子和分子可吸收能量（如光能，热能，电能，机械能等）使电子跃迁到较高能级而处于激发态。处于激发态的原子和分子是不稳定的，可通过多种途径将多余的能量释放而回到稳定的基态。这个过程即激发态的弛豫过程。 分子从最低激发单线态（s1）的最低振动能级向基态（s0）跃迁时的辐射，称为荧光。,荧光光谱和荧光激发光谱,荧光光谱是用适合的波长做为激发光照射样品（通常是用它的吸收光谱的峰位波长），将得到的不同波长的荧光强度记录下来，以荧光强度为纵坐标，以荧光波长为横坐标，画出的曲线即为荧光光谱。 荧光激发光谱是以不同波长的光激发样品，记录某一波长荧光的强度（通常是其荧光光谱峰位的波长）。这样以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标画出的曲线即为荧光激发光谱，简称激发光谱。激发光谱说明哪种激发光波长荧光效率最高。该激发光波长往往与该物质的吸收光谱中的峰位波长一致。这就是为什么时常将一物质的荧光激发光谱代替其吸收光谱的原因。,荧光的特点,一：光谱红移 任一物质的荧光光谱及其峰位的波长总是比它的吸收光谱及其峰位波长要长，这现象称为光谱红移或stokes位移，简言之，任何物质的荧光波长总比其吸收波长长。 二：镜像对称 物质的吸收光谱和荧光光谱，两个光谱总有一个交叉点，通过此交叉点画一条垂直于横坐标的直线，就可看到左右两个光谱是镜像对称的。 三：荧光的第三个特征就是任一物质的荧光光谱不决定于激发光的波长，但是荧光强度与激发光波长有关。,荧光显微镜和 普通显微镜的区别 1.照明方式通常为落射式； 2.光源一般采用超高压汞灯(50-200w)； 3.滤色系统（激发滤片、双色束分离器和发射滤片等）。,明场：透射式 荧光：落射式,落射式与透射式的区别 透射式： 激发光源是通过聚光镜照射到标本材料上来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光反射到标本上这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱，所以对观察较大的标本材料较好。 落射式：即激发光源通过物镜投射于样品上，用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，,并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由样品散射的激发光同时被物镜收集，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。,荧光滤色系统 激发滤片：仅使一定波长的激发光透过照射到样品上，而将其他波长的激发光都吸收掉。 双色束分离器（分束器）：反射激发光并分离激发光和荧光的作用。 发射滤片：荧光一般都比激发光弱，为能观察到样品的荧光，在物镜后面需加发射滤片（阻断或带通滤光片）。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜以免干扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。激发滤片和发射滤片两者必须选择配合使用。,滤光片的分类 长通滤光片（lp）：允许波长大于某一波长的光波通过，其他光被吸收。 短通滤光片（kp）：允许波长小于某一波长的光波通过，其他光被吸收。 带通滤光片（bp）：允许某一波段范围内的光波通过，其他光被吸收。 分束器（beam splitter）：允许波长大于（或小于）某一波长的光波通过，其他光被反射。,分束器原理,nikon e600正置荧光显微镜配置 荧光滤光块参数 1： ex 330-380 dm400 ba435 2： ex 400-440 dm455 ba520-560 3： ex 440af21 dm455 ba480af30 4： ex 450-490 dm505 ba520-560 5： ex 510-560 dm575 ba610 物镜参数 10x/0.30 wd 16.0mm 20x/0.50 wd 2.1mm 40x/0.75 wd 0.72mm 100x/1.30 oil wd 0.20mm,蔡司lsm 510系统配置的倒置荧光显微镜（axiovert 200m）荧光滤光块参数 filter set 01： ex bp 365/12 bs ft 395 em lp 397 filter set 09： ex bp 450-490 bs ft 510 em lp 515 filter set 15： ex bp 546/12 bs ft 580 em lp 590 filter set 17： ex bp 485/20 bs ft 510 em bp 515-565 filter set 46： ex bp 500/20 bs ft 515 em bp 535/30 filter set 47： ex bp 436/20 bs ft 455 em bp 480/40 filter set 48： ex bp 436/20 bs ft 455 em bp 535/30,蔡司lsm 510 meta系统配置的倒置荧光显微镜（axio observer.z1）荧光滤光块参数 filter set 49： ex g 365 bs ft 395 em bp 445/50 filter set 10： ex bp 450-490 bs ft 510 em bp 515-565 filter set 20： ex bp 546/12 bs ft 560 em bp 575-640,光源 由于荧光和激励光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强度必须很高，即使在近紫外区，也必须有足够的强度，为了满足上述要求，通常采用超高压汞灯，但有时为了特殊需要，也采用氙灯或卤素灯。,超高压汞灯 超高压汞灯是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达5070个标准大气压力，这一过程一般约需515min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此为荧光显微镜普遍采用。,1标准大气压（1atm）=1.01325105pa,超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。200w超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸。,蔡司倒置荧光显微镜axio observer.z1和axiovert 200m使用的汞灯为欧司朗（osram）短弧汞灯，型号hbo 103w/2。,氙灯(xbo)：氙灯与高压汞灯不一样，自紫外至近红外区是一条连续光谱。特別在可见区，氙灯和自然光十分相似。因此，它适用于荧光光度法中，作测定激发和荧光光谱之用。 汞灯和氙灯都是放电电弧，在玻璃管中封入一对电极和一些特定物质，并使电极之间放电。根据激发和压力条件，封入的物质(气体)辐射出一种特定的光谱。因需要有高电压因此代价贵。 卤素灯：是一种光学显微镜作为光源最常用的灯。它和放电灯相比，使用方便，价格便宜，因此可用在不需要紫外线区或高光强激励光的观察中。,使用荧光显微镜的注意事项 （1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。 （2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。 （3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 （4）检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射35 min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过23h。 （5）荧光显微镜光源寿命有限 ，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 （6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。,样品准备 在荧光显微镜下观察的标本，当然必须发出荧光，可是大多数标本本身不能发出荧光，因而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。 样品大致可以分成以下四大类： 1. 自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色，也能发