大鼠局灶性脑缺血脑组织的比较蛋白质组学研究.doc

大鼠局灶性脑缺血脑组织的比较蛋白质组学研究大鼠局灶性脑缺血脑组织的比较蛋白质组学研究王继生1，邱宗荫*2，夏永鹏2，李惠芝2（1 绵阳市第三人民医院 绵阳 621000；2 重庆医科大学药学院 重庆 400016）摘要摘要目的目的 建立局灶性脑缺血模型，从蛋白质整体水平探讨脑缺血/再灌注的保护作用机制。方法方法 雄性、健康大鼠SD，随机分为正常组、脑缺血模型组参照Koizumi法并加以改进，建立MCAO大鼠脑缺血2h再灌注24h的模型；裂解液提取总蛋白质，以双向电泳技术进行蛋白质分离，考马斯亮蓝染色，获得双向电泳图谱，利用专门的软件筛选出差异蛋白质，用MALDI-TOF-MS获得肽指纹图谱，MS-Fit数据库进行搜索，获得有关的蛋白质信息。结果：结果：局灶性脑缺血模型组与正常组脑组织的比较蛋白质组学研究。与模型组比较，从正常组筛选到23个差异表达蛋白斑点，其中13个低表达，10个高表达，鉴定其中6个蛋白质，发现白细胞三烯A-4水解酶、促甲状腺激素释放激素降解胞外酶等与脑缺血相关的蛋白质。结论结论：从蛋白质组学角度发现了一些与脑缺血相关的蛋白，有助于今后进一步研究脑缺血性损伤的保护机制。关键词关键词 脑缺血 蛋白质组学 A COMPARATIVE PROTEOME STUDY ON FOCAL CEREBRAL ISCHEMIC TISSUE OF RAT BRAINWang Ji-Sheng1, Qiu Zong-Yin2, Xia Yong-Peng2, Li Hui-Zhi2 (1.The third hospital of mianyang, mianyang 621000; 2 Department of Pharmacy, ChongQing University of Medical Science. ChongQing 400016)ABSTRACT Objective: To establish a model of focal cerebral ischemic tissue of rat brain and explore the protective mechanism of focal cerebral ischemia reperfusion in whole level of proteins. Method: Male and healthy SD rats , were classified them into normal , Model at random. Established the MCAO model with suture method by reperfusion 24h after ischemic 2h according to Koizumi，s method, extracted total proteins with Lysis buffer,separated proteins by two-dimensional electrophoresis(2-DE), stained proteins by Coomassie brilliant blue ,got the patterns ,found out differential * *绵阳市科委资助课题（编号：06S042-7）作者简介：王继生（1974） ，男，药理学博士，研究方向：新药开发的药理学研究及蛋白质组学，Email：wjs327proteins ,and obtained PMS by MALDI-TOF-MS, gained related the information of proteins by MS-Fit database.Result:.A comparative proteome study of model and normal group. Compared with model group, the normal group gained 23 differential protein spots, 13 spots expressed lowly, and 10 spots high, identified 6 protein spots，found out the relative cerebral ischemic proteins such as Leukotriene A-4 hydrolase， Thyrotropin-releasing hormone-degrading ectoenzyme etc.Conclusion: Establishing a 2-DE technology was applied to protein analysis of brain tissue ,and found out the relative proteins of from proteome aspect. This would profit from the protective mechanism of cerebral ischemic tissue.KEY WORDS： cerebral ischemic; Proteomics；脑血管病是危害人类生命与健康的常见病和多发病，以其高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率严重危害人类的健康。脑血管病中尤以脑缺血多见，它是指脑循环血流量减少为特征的中枢神经系统疾病，是中老年人常见病。脑缺血损伤的机制十分复杂1，目前有关脑缺血损伤的机制有钙超载，细胞凋亡，自由基，兴奋性递质等，这些研究尚不能完全阐明缺血及再灌注损伤的机制。在大脑损伤中，大量的局部缺血的脑梗塞，是一种血液供给损失行为，在相关的病例中水肿，颅内高血压和死亡占了 80%2。大脑中动脉（Middle cerebral artery，MCA）供血区是临床上缺血性脑血管病的多发部位，大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型被认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，该模型制备，具有方法简便，不改变大鼠颅内压，缺血时间可控的优点，可以模拟临床上的脑缺血，适用于缺血/再灌注损伤机制和保护大脑的药物研究，以及脑梗死缺血的病理生理研究等。蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者，蛋白质不仅是多种致病因子对机体作用重要的靶分子，而且也成为大多数药物的药靶乃至直接的药物。蛋白质组学是近年来新兴的、最具潜力的发现药靶的技术平台。蛋白质组(proteome)源于蛋白质(protein)与基因组(genome)两个英文单词的组合，于1994 年由两位澳大利亚科学家 Wilkins 和 Williams 提出，它指细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式，后引申为一种基因组所表达的全套蛋白质，而一种基因组可包括一种细胞乃至一种生物。近年来，以双向电泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DG)为核心的蛋白质分离技术和以质谱方法为主的蛋白质鉴定技术等体系已基本成熟3，4。本课题采用比较蛋白质组学研究策略，对局灶性脑缺血模型大鼠的脑组织进行研究。以双向电泳为分离手段，以基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）为检测手段；利用生物信息学对所得实验结果进行解析，从而获取健康、病状态下脑组织蛋白质组表达的差异数据，以探讨脑缺血的保护机制。材料与方法材料与方法一一 实验设备实验设备2K15低温离心机 Sigma Co. German;UV-1601 型紫外分光光度仪 Shimadzu（岛津）Japan;pHS-2 型酸度计（精度0.02pH） 上海第二分析仪器厂;自动双重纯水蒸馏器（SZ-93） 上海亚荣生化仪器厂;Voyager DE Pro基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）美国ABI公司;VIRTIS型冷冻干燥机为VIRTIS公司产品。二二 主要试剂主要试剂乙腈（ACN）为 Fisher 公司产品，三氟醋酸（TFA）为 Fluka 公司产品，测序级胰蛋白酶（Promega sepuencing grade modified trypsin）为 Promega 公司产品，质谱外标混合液 Mixture 2包括以下片段：Angiotensin I 1297.51; ACTH(1-17) 2094.46; ACTH(18-39) 2466.72; ACTH (7-38)3660.19; insulin 5734.59 (+1),2867.80(+2)、-氰基-4-羟基肉桂酸（-cyano-4-hydroxycinnamic acid）为Sigma 公司产品。三三 实验方法实验方法1 实验动物实验动物成年健康雄性 SD 大鼠，体重 250300g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。合格证号：SCXK（渝）2001003，清洁级。实验过程中的动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。2 大鼠大脑中动脉局灶脑缺血大鼠大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型制备再灌注模型制备4。将大鼠用3.5%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，仰位固定后手术。颈正中切口，长约 3cm，锐钝结合分离颈部筋膜，向外牵引胸锁乳突肌，离断二腹肌，打开颈动脉鞘，暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）；由 CCA 分叉处向头端依次游离，电凝 ECA 所有分支，在甲状腺上动脉远端结扎、切断 ECA，使其主干游离备用；用蛙心夹暂时夹闭 CCA 和 ICA，用剪刀在 ECA 残端作一环形切口，将预先制备好的头端涂有聚氨酯的尼龙线插入 ICA（涂有肝素），缚紧 ECA 残端丝线以防线栓滑出和出血，移去蛙心夹将线栓缓慢沿 ICA 入颅方向推进，推进约 1.7-2.0cm 时感到阻力，表明线栓已经通过大脑中动脉的起始部，完成一侧大脑中动脉的阻塞；松开夹闭 CCA 的蛙心夹，清理术野，全层缝合，关闭切口；大脑中动脉阻塞 2h 后打开手术切口，轻轻拔出线栓，微感阻力时停止，实现再灌注，清理术野，关闭切口。假手术组除不插线外，其余步骤同上，再灌注24h。3 实验分组。实验分组。Wistar大鼠雄性12只，实验动物随机分为2组：缺血组，对照组。4 取材取材在脑缺血2h再灌注24h点用3.5%水合氯醛麻醉大鼠后，断头取脑，冰盘中取缺血区脑组织，称重，液氮冻存。 5 蛋白质含量测定蛋白质含量测定采用Bradford法进行蛋白质定量5。以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白，配成浓度为1g.L-1的溶液。分别取10、20、40、60、80、100L标准蛋白溶液。加入不同试管，定容至100L。各管分别加入5 mLBradford工作液：0.01%考马斯亮蓝G-250、4.7%乙醇(v/v)、8.5%磷酸(v/v)充分混匀,放置5min,于570 nm处测吸光度，20min内测完。以蛋白浓度为横坐标（x,g/L），吸光度为纵坐标（y,OD595nm ），作标准曲线，获得线性方程;测出待测样品的595nm处吸光度值6 蛋白质双向电泳分离及凝胶染色蛋白质双向电泳分离及凝胶染色 主要参考 BIO-RAD PROTEAN IEF cell 型等电聚焦仪 操作指南进行。本实验采用固相 IPG 预制的线性 17cm 干胶条（pH3-10，L） 。取正常大鼠脑组织样品与缺血脑组织各 3 份，分别上样。蛋白质上样量为 2mg，并使水化上样缓冲液和样品总体积为 400l，进行电泳。电泳结束后，在固定液中固定，经染色液染色，然后在脱色液中脱色，直至凝胶背景变为无色。7 图象分析图象分析Amersham ImageMasterVDS-CL 型凝胶成像系统对考马斯亮蓝 R-250 染色的2-DE 胶进行扫描，ImageMaster 2D V2002.1 图像分析软件产生光密度图像 （make OD image） ，随后进行蛋白斑点检测，凝胶匹配，根据 Normalised Volume 值的变化来判断蛋白斑点表达量的变化，选取部分差异表达候选蛋白作MALDI-TOF 质谱分析。8 蛋白质鉴定方法蛋白质鉴定方法本课题蛋白质鉴定使用的是 PMF 法，蛋白质从二维电泳凝胶上切下，经胰蛋白酶胶内酶解，质谱分析得到肽指纹图谱，然后在互联网上进行肽指纹图谱的比对鉴定。8.1 蛋白质的胶内酶解蛋白质的胶内酶解从 2-DE 凝胶上切下蛋白斑点，切碎成 1mm3装入 200l 的 EP 管中，水洗三次。用 50ACN/25mM 碳酸氢铵 400l（pH8.0）脱色 15min。反复三次，直至颜色脱尽。胶块浸入 100ACN（ACN 中不能有酸性物质）中 5min，脱水，胶块变白，室温抽干。加 1015l Trypsin 酶液（Promega sequencing grade modified trypsin, 浓度为 1015g trypsin /mL，用 25mM pH8.0 的 NH4HCO3溶液配制）覆盖胶块，4放置 60min，胶块吸胀后，吸去多余的酶液，37过夜 1215h 左右。吸出反应液，加入 50ACN/5TFA 混合液 3050l，轻微振荡萃取3060min，共两次。萃取液（合并萃取液和反应液，可选）抽干约 1h，加入 3l 50ACN/5TFA 混合液溶解。进行质谱分析。8.2 MALDI-TOF-MS制备好的样品用美国 ABI 公司的 Voyager DE-PRO MALDI-TOF 质谱仪分析。参数设置如下：反射模式，正离子谱测定，N2激光源波长为 337nm，真空度 810-8 Torr，离子源加速电压为 20KV，脉冲宽度为 3 ns，离子延迟时间 100ns，Grid 75%，Guide Wire 0.003%，基质为 CHCA，激光强度为 8501200 内部单位，质谱信号单次扫描累加 150 次。外标采用混合的 Mixture 2 标准液进行相邻校正，内标采用胰蛋白酶的自切峰（MH+：2211.10 Da 或 2283.18 或 2299.18和 842.51 Da）进行两点或单点校正。9 数据库搜索数据库搜索 我们选择 ProteinProspector 检索软件，在 MS-Fit 界面进行检索，检索参数为：database (SWISS-PROT); species: (RATTUS NORVEGICUST); enzyme (Trypsin) ; peptide values (MH+, monoisotopic); Peptide Mass tolerance (2); Peptide Charge State (1+); Max Missed Cleavages (01); Possible modifications mode (Carbamidomethyl, C)。数据库查询后，每个查询得到一个分值2 结果电泳图谱经过图像分析，模型组分辨出约 755 个蛋白质斑点；正常组分辨出约 780 个蛋白质斑点；模型组与正常组的匹配率为 79%。以模型组为对照，从正常组筛选到 23 个差异表达蛋白斑点，其中 13 个低表达，10 个高表达（图 1）；鉴定其中 6 个蛋白质，其中 4 个高表达，2 个低表达，对这 6 种蛋白质的性质与功能进行总结如下：图图 1 脑脑缺血缺血 2h 再灌注再灌注 24 h 模型模型组组与正常与正常组图谱组图谱， ，pH 3-10， ， 线线性，性，17cm IPG 胶条，考染胶条，考染Fig:1 coommacie blue-stained 2-DE image(normal and model) of reperfusion 24h after ischemic 2h of cerebral tissue proteins in rats.IPG gel pH 3-10 L 17cmA、 、 Model group B、 、Normal group表表 2-7 模型模型组组与正常与正常组组比比较较，相关差异蛋白的表达情况，相关差异蛋白的表达情况Tab 2-7 expression of relative differential proteins between model and normal group序号（对应序号（对应蛋白质点）蛋白质点）蛋白名称蛋白名称表达类型表达类型PI/MW主要功能主要功能1（16）白细胞三烯 A-4 水解酶（LTA-4 水解酶）低表达69045/5.7水解环氧化白细胞三烯 A4(LTA-4)的一部分，从而形成白细胞三烯 B4(LTB-4)。这种酶也有一些肽酶 a 的活性。2（22）促甲状腺激素释放激素降解胞外酶（TRH-降解胞外酶） （TRH-DE） （TRH-特异性的氨基肽酶）低表达117288/6.5TRH 释放后，使它特异性的失活。3（15）Rap 鸟嘌呤核苷酸交换因子 3（cAMP-调节鸟嘌呤核苷酸交换因子 I）高表达100258/8.7Rap 鸟嘌呤核苷酸交换因子（cAMP-调节鸟嘌呤核苷酸交换因子 I）是 RAP1A 和 RAP2A 的小的鸟苷三磷酸酶，通过结合 cAMP 而活化。4（7）环指区域蛋白 1 的细胞生长调节因子（细胞生长调节基因 19 蛋白）高表达37443/5.1能抑制多种细胞株的生长。5（13）-氨基丁酸受体亚基 -2 前体(GABA(A)受体亚基 -2)高表达54078/8.7在脊椎动物的大脑里，-氨基丁酸是一种主要的抑制性的神经递质，通过结合GABA（A）受体，苯(并)二氮类受体和开放一个完整的氯离子通道，从而起到间接的神经元抑制。6（3）白细胞介素前体（IL-18）（干低表达22304/4.9增强自然杀伤细胞的活力脾细细胞，兴奋干扰素 产品在T 辅助细胞 I 型细胞。扰素- 诱导因子）3 讨讨 论论模型组与正常组的 2-DE 图谱的差异蛋白质点，经 MS 分析，获得 PMF 图谱，经 MS-Fit 搜索，得到 6 种蛋白质，现讨论如下：白细胞三烯 A-4 水解酶（Leukotriene A-4 hydrolase，LTA-4H），水解环氧化白细胞三烯 A4，形成白细胞三烯 B4(LTB-4)。白细胞三烯 A-4 水解酶/氨基肽酶是一种双功能的锌金属酶，转化脂肪酸环氧化白细胞三烯 A-4 水解白三烯B4。白细胞三烯 A-4 水解酶的结构显示，Glu-271 属于一个保守的 GXMEN 基序，在 M1 家族的锌肽酶 a，Glu-136 位于活化的位点3。白细胞三烯 A-4 水解酶在浸润的炎症细胞中和在人的食道癌柱状细胞表达。通过大鼠食道癌模型，白细胞三烯 A-4 水解酶抑制剂抑氨肽酶 b，减少了食道腺癌的发生率大约 30%。根据这些研究，可以推断出：LTA-4 水解酶过分表达出现在食道癌是一个早期事件，对预防食道癌来说可能是一个靶标。Chen 等报道 LTA-4H 在人和鼠的食道癌过分表达4。白三烯，如 LTA4和 LTB4的产生，主要通过炎症细胞，如多形核细胞，巨噬细胞和肥大细胞5。这些研究表明，白细胞三烯 A-4 水解酶可能与脑缺血炎症有关。促甲状腺激素释放激素降解胞外酶（Thyrotropin-releasing hormone degrading ectoenzyme，TRH-DE） ，又名TRH-特异性的氨基肽酶，主要分布在垂体后叶素；主要在大脑和脑下垂体表达，而在肺和肝脏低表达。TRH降解胞外酶，作为一种在腺垂体靶点的TRH信号调节基因，其转录物仅在TRH产生的腺瘤显著表达。由此推断，TRH信号元素检测，通常与肢端肥大的病人引起的异常的GH分泌物没有直接的关系6。研究表明：异常的垂体激素（GH，LH和FSH的 ， 亚基）通过TRH释放7，一般与通过腺瘤细胞的TRH生物合成和信号接收位点的TRH-R和TRH降解胞外酶的主组分无关。异常的GH分泌物，不仅由TRH产生，而且通过其它的下丘脑释放因子（如CRHT和LH释放激素）8。在大多数病理、生理的条件下如肾衰竭、糖尿病、肝脏疾病，药物成瘾性及多方面原因引起的精神障碍等，TRH诱导GH释放。近年来的研究发现TRH放其类似物能够促进中枢神经系统损伤后功能的恢复、但具体机制尚不清楚。目前有几种假说，包括：增加脑血流量、拮抗内源性阿片肽的作用、抗白三烯和血小板激活因子的病理生理作用等。Rap 鸟嘌呤核苷酸交换因子 3，又名 cAMP-调节鸟嘌呤核苷酸交换因子I，cAMP-GEFI 和 Eapc1。直接通过 cAMP 活化的交换蛋白质（exchange protein directly activated by cAMP，Epac）是一种 Rap 特异性的鸟苷酸交换因子，通过结合 cAMP 到环状的核苷酸一磷酸结合区域而被激活。有两种亚型，Epac1 和 Epac2，在哺乳动物细胞，两者都含有一个调节和催化的区域，在蛋白质的 N-和 C-的末端。调节区域包含 cAMP 结合位点，在缺乏 cAMP 的情况下，自动抑制催化活性。胞吐外排的 Epac1，首先出现在特异性阻滞剂激肽原酶缺乏效应，和环核苷酸门控通路9。Epac 蛋白质的功能（受体介导 H-Ras and ERK 激活），通过 Rap 鸟苷三磷酸酶活性的抑制剂（通过 RapGAPII 的表达），而被抑制10。环指区域蛋白 1 的细胞生长调节因子，又名细胞生长调节基因 19 蛋白。主要存在组织：纤维母细胞。主要功能：能抑制多种细胞株的生长。组织特异性：在睾丸高表达，在骨骼肌，肝，肺和脑低表达。诱导：被 p53 诱导11。-氨基丁酸受体亚基 -2 前体，在哺乳动物大脑中 -氨基丁酸 A 型受体(GABAA-Rs)是主要存在的抑制性的受体，通过大多数镇静剂和安眠药调制。特异性的(GABAA-Rs)亚基,就活性和在活体内的药物反应而言,尚不是十分清楚12。2 亚基在整个的发育和成熟的大脑和脊索高表达,它大约占了整个 GABAA-Rs的 60%13，也是必需的 GABAA-Rs 突触的聚类14。 2 亚基是苯(并)二氮类受体结合位点的必需的结构,但在装配运输和插入完整的功能性的 GABAA受体神经元的质膜不是必需的15。白细胞介素-18前体（IL-18前体）又名，干扰素-诱导因子，主要分布于脑，肾上腺，垂体前叶等组织。Carbone A等在人类的胰腺癌细胞的研究中发现，在药物治疗期间，通过T细胞16，癌细胞产生的IL-18，可提高IFN-的产量。这提示：IL-18充担了抗肿瘤机制的介导作用。此外IL-18能够发挥与其它细胞因子的协调作用，如IL-23或增强抗肿瘤免疫的一氧化氮合酶抑制剂17。在非实体的肿瘤模型中，这种细胞因子没有抑制作用，主要体现在人类的非白血性白血病细胞株中18。IL-18抑制效应的机制归因于细胞分裂周期的调节作用，导致S期停止。它证实了在几种研究中，S期停止经常伴随着干扰细胞周期控制蛋白。如缺氧诱导的S期停止，在人的胸部（T-47D）和颈部的（NHIK 3025）癌细胞株并行向下调节细胞周期调节蛋白A19。白细胞介素l8还可以刺激白细胞介素1、肿瘤坏死因子及白细胞介素8等其他炎性细胞因子的生成，促使炎性细胞向炎性区域聚集，共同促使缺血后脑组织中的过度炎症反应20。参考文献参考文献1Janardhan，V Qureshi AI.Mechanisms of ischemic brain injuryJCurr Cardiol Rep,2004：6(2)：l1723. 2Nobre MC，Monteiro M, Albuquerque AC，et,al.Decompressive craniectomy for treatment of intracranial hypertension secondary to large ischemic cerebral infarction: analysis of 34 casesJ.Arq Neuropsiquiatr,2007,65(1):107-133 Peter C, Rudberg, Fredrik Tholander, et al.Leukotriene A4 Hydrolase/Aminopeptidase Glutamate 271 is a catalytic residue with specific roles in two distinct enzyme mechanismsJ. 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