海洋微藻多糖提取纯化条件的研究.doc

海洋微藻多糖提取纯化条件的研究吴曼, 李文权, 张赛金, 陈清花( 厦门大学海洋学系、亚热带海洋研究所, 福建 厦门361005)摘要: 研究了提取介质、超声条件和洗脱条件对海洋微藻多糖提取纯化效果的影响。 实验结果表明不同pH 的提取介质可以提取得到不同种类的多糖, 超声条件以 300 W、20 min 最佳, 用葡聚糖凝胶 Sepha dex- G200柱(长 50cm, 直径 2 cm) 纯化粗多糖, 当加样量为 4 ml, 用 0. 2 mo l/ L NaCl 溶液洗脱效果最好。关键词: 海洋微藻; 多糖; 提取纯化海洋微藻富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、多糖和维生素等生物活性物质。海洋微藻多糖不同于陆生高等植物多糖, 其中硫酸多糖具有独特的化学结构和药用价值。例如螺旋藻多糖虽然仅占微藻干重的10% 1, 但由于其特殊的化学结构而具有独特的药用价值。Hayashi 2- 4等用热水从螺旋藻中提取一种新型硫酸多糖 ( Ca- SP) , 具有显著的抗病毒活性。因此, 加快海洋微藻生物活性物质的开发可以弥补陆地植物及大型海藻药用特性的不足。目前对海洋微藻多糖的研究远不及陆地植物和大型藻类多, 国内此类研究报道极少。本文以海水小球藻( MarineChlorel la )、球 等 鞭 金 藻 ( I sochry sisgalbana) 为研究对象, 研究了海洋微藻多糖的提取、分离纯化条件, 建立了海洋微藻多糖提取纯化的最优方法, 为进一步认识和开展海洋微藻多糖研究提供了实验基础。1材料与方法1. 1材料海水小球藻藻种引自厦门大学生物系, 球等鞭金藻藻种引自厦门大学海洋生物实验室, 按F/ 2 配方在生化培养箱中培养, 光暗周期为12 h/ 12 h, 取指数生长期的藻液离心过滤, 60烘干, 研磨成粉末。1. 2主要仪器和试剂无水乙醇、 蒽酮、三氯乙酸、 丙酮均为分析纯试剂, 葡聚糖凝胶Sephadex- G200 为生化试剂, 凝胶柱长50 cm, 直径2 cm。主要仪器为VCX600 型超声波细胞破碎仪 ( S&M Inc, U SA) 和LD4- 2 离心机 ( 北京医用离心机厂) 。1. 3多糖提取纯化工艺流程干藻粉称重, 加入提取介质后超声破碎, 于80水浴提取1 h。离心取上清液, 3 倍体积无水乙醇沉淀, 加3%三氯乙酸溶解沉淀, 再用3 倍体积无水乙醇沉淀。丙酮洗涤沉淀, 烘干沉淀得到粗多糖。粗多糖经 Sephadex- G200 柱层析, 洗脱后获精多糖。碳水化合物含量用硫酸- 蒽酮比色法测定 5。2结果和讨论2. 1不同提取介质对多糖提取的影响分别采用4%NaOH、 蒸馏水和盐酸( pH= 3) 作为介质对海水小球藻提取和分离纯化。不同提取介质对海水小球藻多糖提取率的影响见表 1。超声条件为功率450 W, 超声时间20 min, 脉冲9. 9 s、间隔3. 3 s。柱层析纯化条件是加样量 3 ml, 以0. 2mol/ L NaCl 溶液为洗脱液。由表1 可知, 超声破碎协同稀碱法的粗多糖提取率远大于相同超声条件下的蒸馏水法和盐酸法, 但稀碱法得到的粗多糖经葡聚糖凝胶柱分离纯化后, 精多糖提取率有明显的降低, 表明稀碱法提取多糖容易引入杂质。比较3 种介质条件下提取的精多糖含量可知, 超声协同蒸馏水法相对提取率较高, 得到的粗多糖的杂质含量较低。不同提取介质下所得粗多糖经Sephadex- G200柱纯化, 洗脱曲线见图1、2、3。由图可知, 用稀碱提取可得到两种精多糖分别为ADT 1 和ADT 2, 而水提和酸提都只得到一种精多糖, 分别命名为WDT 和HDT。经气相色谱和红外光谱分析可知,ADT 1 和 ADT 2 都是均多糖。ADT 1 由葡萄糖组成, ADT 2 由半乳糖组成, 并且均含有乙酰氨基, 但都不含硫酸基。 WDT 和HDT 均为杂多糖, WDT 由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7 种单糖组成, HDT 由鼠李糖、 阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6 种单糖组成, 都含有乙酰氨基和硫酸基。这说明不同的提取介质可以提取得到不同种类的多糖, 这与Ray 6提出的在同一种溶剂作用下多糖很难被完全提取的结论相符。表 1不同提取介质下海水小球藻多糖的提取率介质 4%NaOH 蒸馏水 盐酸( pH= 3)粗多糖/干藻重( %) 25. 20 4. 24 1. 87精多糖/干藻重( %) 2. 57 3. 12 1. 32精多糖/粗多糖( %) 10. 2 73. 6 70. 62. 2超声条件优化实验海洋微藻多糖主要存在于藻类细胞壁和细胞质中,采用超声破碎方法破碎细胞,可以提高多糖提取率。超声破碎由3 个条件需要设定, 即超声功率、 超声时间和超声作用方式(脉冲)。本实验固定脉冲时间9. 9 s, 间隔3. 3 s,改变超声功率和超声时间,研究它们对海洋微藻中多糖提取率的影响。2. 2. 1 超声功率对海洋微藻多糖提取的影响在超声脉冲9. 9 s、 间隔3. 3 s, 超声时间20 min的条件下,改变超声功率为0 W、 150 W、300 W、450W、480 W,蒸馏水体积 70 ml,按1. 3 流程提取海水小球藻中的多糖,结果见表2。表 2不同超声功率对海水小球藻多糖提取率的影响超声功率( W) 碳水化合物含量(占干藻重 %)粗多糖含量(占干藻重%)粗多糖/ 碳水化合物( %)0 4. 1 0. 8 19. 7150 7. 6 3. 4 45. 1300 8. 2 5. 1 61. 9450 11. 3 4. 2 37. 7480 7. 2 3. 1 44. 2由表2 可知, 与无超声提取的结果相比较, 超声破碎协同蒸馏水法大大提高了海水小球藻碳水化合物和多糖的提取率, 提取率提高了 2至 5 倍, 多糖在碳水化合物中的比例也增加了2 至3 倍, 说明超声破碎有利于多糖这种高分子化合物的提取。但是多糖的提取率并不随功率的增加而线性提高, 实验结果显示当功率为450 W 时, 碳水化合物的提取率达到最高11. 3%, 而超声功率增加为480 W 时,提取率反而下降至7. 2%。 尽管功率为450W 时, 碳水化合物的提取率达到最高, 但其中多糖的比例下降, 粗多糖占干藻重仅为4. 2%, 低于功率300 W 时的提取率。因此, 以多糖提取率作为衡量标准, 超声功率为300 W 时提取效果最佳, 此时多糖在碳水化合物中的比例可达61. 9%。这与糖类的对热不稳定性以及超声对多糖结构的影响有关。 较高温度下,糖类易发生分解反应, 导致提取率降低。2. 2. 2超声时间对海洋微藻多糖提取的影响在脉冲9. 9 s、间隔3. 3 s, 超声功率为300 W等条件下, 改变超声时间为10 min 、15 min、20min、25 min, 保持蒸馏水体积70 ml 提取球等鞭金藻多糖, 结果见表 3。由表3可知, 超声时间长有利于球等鞭金藻多糖的提取, 但时间太长反而不利于总碳水化合物的提取。考虑超声时间太长会使热量在溶液中积聚可能引起多糖的结构变化等因素, 本文认为超声20min 比较适宜。2. 3葡聚糖凝胶柱Sephadex- G200 洗脱条件实验2. 3. 1洗脱液离子强度对柱效的影响保持加样体积3 mL、洗脱速率 12 mL/ h 和每分样4 mL 一定的条件下, 分别用0. 2 mo l/ L、0. 5mol / L 的NaCl 溶液和NaCl 浓度梯度 (即先用12mL 的0. 1 mol / L 的NaCl 溶液, 然后再用20 mL 的0. 2 mol / L 的 NaCl 溶液, 最后用 32 mL 的 0. 5mol / L 的NaCl溶液洗脱) 等3种不同洗脱液, 对水提海水小球藻多糖溶液( 1. 3 mg/ mL) 进行洗脱。 洗脱曲线见图4, 图中显示3 种不同离子强度的洗脱液洗脱均能得到较好的峰型, 无拖尾现象。但洗脱液的离子强度对凝胶柱的回收率有显著影响。当用0. 2 mol/ L 的 NaCl 溶液洗脱时, 柱回收率可达100%。 而梯度洗脱和0. 5 mol / L NaCl 溶液的洗脱,回收率相近, 约为 70%。2. 3. 2加样体积对柱效的影响为了解加样体积对柱效及洗脱效果的影响, 在洗脱速度保持12 mL/ h 不变的基础上, 设计了不同的加样体积 ( 2 mL, 3 mL, 4 mL) , 用0. 1, 0. 2,0. 5 mo l/ L NaCl 溶液分别对相同浓度的海水小球藻多糖溶液 ( 1. 3 mg/ mL) 进行梯度洗脱。洗脱曲线见图5。由图可知加样体积太小不仅会产生拖尾现象而且回收率偏低, 不利于多糖的分离纯化。3mL 和4 mL 的加样体积可以得到满意的峰型, 而加样体积为3 mL 时回收率较低, 仅为70%, 4 mL 的加样量可以得到较高的回收率, 可达95. 0%。3结论海洋微藻多糖提取条件实验结果表明, 不同pH 的提取介质可提取得到不同种类的多糖。其中用 4%NaOH 提取可得 到两种多糖 ADT 1 和ADT 2, 用蒸馏水和盐酸提取均只得到一种多糖, 分别为WDT 和HDT。 超声协同蒸馏水法的提取率最高, 此时粗多糖的提取率为4. 24%。超声功率和时间对多糖的提取率有明显的影响, 当超声功率为300 W, 超声时间为20 min, 可以得到较好的提取效果。采用葡聚糖凝胶 ( Sephadex- G200) 对粗多糖进行柱层析分离纯化, 当加样体积为 4mL, 洗脱液NaCl 浓度为0. 2 mo l/ L 时可达到接近100%的回收率, 分离效果好, 无拖尾现象。参考文献: 1 陈峰, 姜悦 . 微藻生物技术M 第一版 . 北京: 中国轻工业出版社, 1999: 240-272. 2 T ang Mei, Guo Bao jiang . Advanced development of scientific r esearch on Spir ulina: Eff ects o f Spir ulina on the vir us,cancer and im mune system . 华南师范大学学报 (自然科学版) , 1998 ( 1) : 26-32. 3 北京大学生物系生物化学教研室编 . 生物化学实验指导 M . 北京: 人民教育出版社, 1980: 30-31. J . Natur al Pro duct, 1996, 59 ( 1) : 83-87. 4 Hay sahi K, Haysahi T, Kojima I. A na tur al sulfa ted po lysac