肿瘤侵袭转移实验技术.ppt

,肿瘤侵袭、转移实验技术,首都医科大学 2015.11,目录,一、概述 二、细胞划痕实验 三、Transwell 四、裸鼠尾静脉注射实验 五、总结,一、概述,二、细胞划痕实验,细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的迁移能力。,实验优点： 1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2.适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。 3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。 4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。,二、细胞划痕实验,实验材料： 细胞样品 仪器、耗材：6孔板 marker笔 直尺 枪头 试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS,二、细胞划痕实验,1.所有能灭菌的器械都要灭菌 2.超净工作台 紫外线消毒30min 注：需要灭菌的器材包括离心管、吸管筒、移液枪、枪头等,二、细胞划痕实验,4.每孔加入5X105个细胞并培养约24h 注：1.数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整 2.数量少时可培养一段时间至铺满板底,（3. 6孔板背面画线5-6条）,二、细胞划痕实验,5.用1ml枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致 注：.人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷,二、细胞划痕实验,6.吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，再加入无血清培养基，根据需要设加实验组、对照组。 注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞,二、细胞划痕实验,7.放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，（6），12，24小时取样，拍照。,8.计算、比较、分析 image J 软件计算每个视野的划痕面积 /en/,二、细胞划痕实验,新：德国IBIDI（易必迪）技术,1.准备细胞，培养液，culture Insert。 2.将细胞接种于Dish中间的Insert，培养。 3.细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500m宽度的划痕。 4.每隔4-6小时拍照记录。 5.根据收集图片数据分析实验结果,二、细胞划痕实验,谈几点问题： 1.细胞的选择：一般适用于上皮，纤维样细胞系 a.本身有迁移能力，且较强。 b.有极性，方便测量，观察。 c.对无血清有较强的忍受力。,2.观察的时间：一般为0、6、12、24h a.时间太久，无血清，易死亡，相对坚强 b.时间太久，细胞繁殖，假阳性,二、细胞划痕实验,三、Transwell,Transwell是一种应用Transwell 小室来探究细胞共培养 、细胞趋化 、细胞迁移 、细胞侵袭等的问题的实验技术。,三、Transwell,Transwell小室：常用8.0um膜，铺胶130rmb、不铺胶40rmb，可重复利用 上层培养液：无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA 细胞：有侵袭能力细胞 先撤血清让细胞饥饿1224h，再进行实验,材料准备及说明：,三、Transwell, 基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel 下层培养液：含5%10% FBS的培养基， 也可用趋化因子 细胞培养板：6孔板、12孔板、24孔板等， 以24孔最常用,材料准备及说明：,三、Transwell,1.Transwell小室制备 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4风干 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37，30min。,三、Transwell,2.取细胞悬液加入Transwell小室，24孔板小室一般200l。细胞密度为110105个. 3.24孔板下室一般加入500l含FBS或趋化因子的培养基。,三、细胞划痕实验,4.培养细胞：常规培养48h，具体调整,5.结果测定： 直接测定：细胞染色，镜下计数 间接测定：MTT法、荧光试剂检测、结晶紫染色,问：某药可抑细胞侵袭，24h后可抑制细胞增殖，可以培养36h看结果吗？,三、Transwell,直接观察： 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色：推荐采用0.1%结晶紫固定染色。 细胞计数：把小室反过来直接观察或把膜切下直接染色，取若干个视野计数细胞个数,问：、先后问题？,三、Transwell,间接观察：结晶紫法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色：推荐采用0.1%结晶紫固定染色。 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。,四、裸鼠尾巴静脉注射,小鼠肿瘤转移模型分类： 1.人工转移模型：将肿瘤细胞体外培养株或腹水等行注射，在肺(尾静脉注射)、脑(颈动脉注射）肝脏(肝动脉注射）等部位观察 2.自发转移模型：肿瘤细胞接种在小鼠腋部或足趾的皮下、腹腔肌肉或原组织中，观察转移灶。,四、裸鼠尾巴静脉注射,1.裸鼠的选择：4-6周裸鼠、价格约100+rmb 2.细胞的选择：查阅文献，选择合适细胞株； 细胞浓度：具体不定，动物肿瘤一般接种2600万/只就100%成瘤，而人癌则需要1000万以上才能较高的成瘤,四、裸鼠尾巴静脉注射,3.注射技巧： 固定：50ml离心管自制或购买成品 注射位置：鼠尾部侧面的2条静脉，一般在尾部远端的1/3到1/2处进针。 注射：选择1-2ml注射器，针头采用4号或4.5号。 凸显静脉：温水，烤灯等,四、裸鼠尾巴静脉注射,问：如何判断已经注射进入： 注射到静脉的推液几乎没有阻力，可快速将液体推完通常600ul可在10秒推完。如果注射到静脉以外，强行推液，阻力较大，注射处周围会出现露水样渗液，而且出针后，出血较少。 并且由于药液瘀阻在