体外抗真菌药敏实验的进展与展望.doc

螃螄节莀袅聿膈荿薅袂肄莈蚇肈莃莇蝿袀艿蒆袂肆膅蒆薁衿肁蒅蚄肄羇蒄袆袇莆蒃薆膂节蒂蚈羅膈蒁螀膁肄蒁袃羄莂薀薂螆芈蕿蚅羂膄薈螇螅肀薇薇羀肆薆虿袃莅薅螁肈芁薅袃袁膇薄薃肇肃蚃蚅衿莁蚂螈肅芇蚁袀袈膃蚀蚀肃腿芇螂羆肅芆袄膂莄芅薄羄芀芄蚆膀膆芃蝿羃肂莂袁螅莀莂薁羁莆莁螃螄节莀袅聿膈荿薅袂肄莈蚇肈莃莇蝿袀艿蒆袂肆膅蒆薁衿肁蒅蚄肄羇蒄袆袇莆蒃薆膂节蒂蚈羅膈蒁螀膁肄蒁袃羄莂薀薂螆芈蕿蚅羂膄薈螇螅肀薇薇羀肆薆虿袃莅薅螁肈芁薅袃袁膇薄薃肇肃蚃蚅衿莁蚂螈肅芇蚁袀袈膃蚀蚀肃腿芇螂羆肅芆袄膂莄芅薄羄芀芄蚆膀膆芃蝿羃肂莂袁螅莀莂薁羁莆莁螃螄节莀袅聿膈荿薅袂肄莈蚇肈莃莇蝿袀艿蒆袂肆膅蒆薁衿肁蒅蚄肄羇蒄袆袇莆蒃薆膂节蒂蚈羅膈蒁螀膁肄蒁袃羄莂薀薂螆芈蕿蚅羂膄薈螇螅肀薇薇羀肆薆虿袃莅薅螁肈芁薅袃袁膇薄薃肇肃蚃蚅衿莁蚂螈肅芇蚁袀袈膃蚀蚀肃腿芇螂羆肅芆袄膂莄芅薄羄芀芄蚆膀膆芃蝿羃肂莂袁螅莀莂薁羁莆莁螃螄节莀袅聿膈荿薅袂肄莈蚇肈莃莇蝿袀艿蒆袂肆膅蒆薁衿肁蒅蚄肄羇蒄袆袇莆蒃薆膂节蒂蚈羅膈蒁螀膁肄蒁袃羄莂薀薂螆芈蕿蚅羂膄薈螇螅肀薇薇羀肆薆虿袃莅薅螁肈芁薅袃袁膇薄薃肇肃蚃蚅衿莁蚂螈肅芇蚁袀袈膃蚀蚀肃腿芇螂羆肅芆袄膂莄芅薄羄芀芄蚆膀膆 体外抗真菌药敏实验的进展与展望近年来，随着肿瘤化疗、器官移植、广谱抗生紊的广泛应用及v的感染的增多，真菌感染的发病率和死亡率在不断升。虽然多种抗真菌药物相继问世，绐真菌病治疗带来了新的转机，但目前关于耐药现象的报道也逐渐增多，因此，无论是对于新抗真菌药物的开发，还是台理地指导临床用药、监控耐药菌株的发生，都迫切需要建立一种准确性高、重复性好的体外抗真菌药敏试验方法。美国国家临床实验标准委员会(NCCIS)于1992年、1995年相继推出了药敏试验方案M27一P、M27一T(全称“酵母菌的液基稀释法抗真菌药物敏感试验方案”)，使医学真菌的药敏试验研究取得了明显进展，此方案具有准确性较高、重复性较好的特点，被众多实验室广泛使用，同时也发现了其本身的不足，于是，在完善凹一T的基础上，NCcIs于1997年6月公布了药敏试验的标准方案M27一A 】。本文拟就近年来体外抗真菌药敏试验的进展和展望作一综述=1 N27一A方案的新内容虽然，N27一P和N27一T方案的应用为体外药敏实验的发展提供了良好的参照，但是，它们本身又存在着许多不足如：药敏方案的应用在检测药物和受试菌种方面尚受一定限制：对ArnH的耐药菌株的监测不足；新生隐球菌在RPMl一1640培养基生长不良；唑类药物终点判读的准确性还需要完善等=根据大量的实验结果，NCCLS推荐的眦 一A，从一定程度上丰富了上述内容。11 抗真菌药物的种类及范围测试药物包括：氟康唑(F皿)、5一氟胞嘧嚏(5一咒)、酮康唑(KCZ)、伊曲康唑(XCZ)和二性霉紊B(AmB)，药物所取的测试范围应该包括质控和参考菌株的MIC值在内，水溶性药物FCZ为012564 ， 、5一FC为012564gtml；脂溶性药物KCZ为0031316腭， 、ICZ 0031316 和AraB0 031316Nml；方案要求：常用的a ra JI婀SkinDisDee l999Vol l5，N0 4脂溶性药物的溶剂DMSO在最终容积的浓度不能超过1，因为浓度过高可抑制真菌活性，所 ，脂溶性药物需采用DNSO溶解，液体培养基稀释。12 培养基配制更加严格 通常情况下，应用RPNI一1640培养基：将RPNI一1640粉末104 g溶于900ml蒸馏水中，加3453g MOPS 至终浓度为0165moFL，直至其溶解：搅拌过程中，应用1moFL NaOH调整其pH至7 0(25)，定容至1oL，滤过灭菌，存于4备用。特殊情况下，选用特定培养基，(1)监测AraB耐药菌株的实验中，选用抗菌液基3号，即Pem,ssay液基。(2)在隐球菌的药敏实验中，选用酵母氮源培养基(YNB)培养基。(3)在终点判读困难的实验中，培养基中加人2葡萄糖有助于增加终点判读的准确性。13 推选优质质控菌株M27一A方案的质控及参考菌株MIC值( )分布范围见表1。药敏实验应该 质控、参考菌株为判定标准，质控、参考菌株的MIC值应处于药物受试浓度范围的中心；在连续进行的实验中，允许质控、参考菌株的MIC值有二个稀释度差异；质控、参考菌株应该向ATCC或具有菌种保藏能力的机构购买。14 明确规定抗真菌药物的敏感、耐药数值范围详见表2。上述数值中，FCZ与ICZ的数值取自于粘膜念珠菌感染的临床资料，5一FC取自于药代动力学的研究结果，从某种程度上，对临床治疗有一定指导作用，但是，它的使用有一定局限性而且敏感、耐药值也不是绝对不变的。对于FCZ，MIC值4 或8 V#,-1均可能是它的敏感值，而克柔念珠菌、光滑念球菌对FCZ有先天耐药的特性，不适应于上述的FCZ的敏感、耐药数值；同样，对于I盘，其敏感、耐药数值仅适合粘膜念珠菌感染的治疗，而侵袭性念珠菌病的敏感、耐药数值尚未确定。方案确定，对于AmB，当MIC值大于1 时，就可作为判断AraB耐药菌株的指标。表2 抗真菌药物的敏感、耐药数值(飓fTId)注： S：敏感SDD：剂量依帻敏感I：临界性耐药R：耐药M27一A的公布，进一步推动了酵母菌、隐球菌对5种抗真菌药物的药敏实验的发展，但是不少作者认为它还有待于进一步完善。A an等认为孵育时间由48小时改为24小时，有利于提高多量法和微量法的一致性，有助于药敏实验与临床疗效确切关系的建立陋 ；Wlite等认为各药物敏感、耐药数值不是绝对不变的，而且有使用局限性，F皿数值仅适于指导念球菌病的治疗，ICZ则适于粘膜念珠菌病 a矧；Samfi等在实验中分别应用了抗菌液基3号和YNH培养基，其实验结果与NCCIS药敏方案取得了高度的一致性，抗菌液基3号可增加AmB耐药株的监测而YNB培养基则弥补了RPMI一1640培养表1 质控和参考菌株MIC值( )分布范围基的不足，如：隐球菌生长不良，孵育时间过长，MIC值过度集中等，但是，这两种培养基有待于进一步标准化，因为不同来源的培养基，其实验结果有差异 。另外，M27一A方案未包括丝状真菌和双相真菌的药敏实验，药敏实验与临床之间的关系也未进一步阐明。2 NCCLS葑敏方案在丝状真菌方面的应用近来，NCCLS抗真菌药敏分会研究的主要方向之一为丝状真菌药敏实验的标准化。由于丝状真菌本身的特点，如：产孢条件难以控制、接种量难以精确量化、孵育时间长等特点，使实验结果难以标准化=Gehrt等研究了接种浓度对MIC值的影响。药物包括AraB、5一FC、ICZ和咪康唑(M2)，菌株包括曲霉、根霉、波氏假阿利什菌和镰刀菌，菌悬液的接种浓度为102 1 CFUml之间的不同梯度，结果表明，不同浓度的菌悬液对MIC值影响有差异，但不同菌株和不同药物所受的影响各不相同。少根根霉、波氏假阿利什菌的药敏实验则最易受影响；对不同药物而言，皿、5一FC最易受影响，AmB、M(E受影响较轻；在5一FC实验中，当曲霉的浓度由10210CFUml时，它的MIC值增加了10倍以上；在l(X实验中，MIC值所受的影响取决于菌株的种类；在少根根霉、渡氏假阿利什菌的实验中，接种浓度对于l(X 的MIC值影响最明显，而在根霉对MCZ的药敏实验中，接种浓度对于MIC值则无明显影响 Pujdl等研究了接种浓度、孵育时间和温度对MIC值的影响，内容为?anB对镰刀菌的药敏实验，结果表明接种浓度由102 CFUml一1 CFUml，MIC值可增加l0一l9倍；孵育时间4872小时，MIC值增加23倍；而温度在25、3o和35C时，M1C值增加仅在2倍之内 。由此可见，接种密度是影响药敏实验结果的主要因素。为了使体外丝状真菌药敏实验标准化，增强各实验室之间的一致性和可重复性，B ndIngof等以NCCLS方案的微量法为基础，进行了多中心、分阶段广泛深人的研究，内容如下：受试菌包括烟曲霉、黄曲霉、申克氏孢子丝菌、少根根霉、波氏假阿利什苗，药物包括anB、ICZ、F(E、MCZ和K盘，接种浓度通过分光光度计，确定分生孢子的浓度为104 CFUhfl，孵育温度35，时间为曲霉和少根根霉24小时，渡氏假阿利什霉和申克氏孢子丝菌为34天，终点判读为75生长受抑制的最低药物浓度，采用肉眼法和指示比色法。结果：(1)以l 04 CFUml为接种浓度实验室内一致性除了一个实验室黄曲霉、波氏假阿利什霉和二个实验室申克氏孢子丝菌不足80以处，其余均高于90；实验室问的一致性，烟曲霉、渡氏假阿利氏霉、少根根霉达94 一97，而黄曲霉、申克氏孢子丝菌为80 一82 、总平均达9o。(2)终点判读标准：肉眼法 ，实验室问一致性达93 一100；比色法，伊曲康唑为89 一95，比色法与肉眼法在实验室内的一致性AraB为97 100，伊曲康唑为9o 一100，而且更适合比色法判读终点 】 由此可见实验室内与实验室问具有高度一致性，微量法与多量法也具有高度一致性，作者认为，此研究可作为丝状真菌药敏实验的研究基础。由于丝状真菌往往以菌丝相侵犯宿主组织，以分生孢子计数的接种密度能否准确反映引起疾病的丝状真菌形式，孢子相的MIC值能否与菌丝相的MIC值一致?孢子相的药敏结果能否真实反映临床上对治疗的反应?EsplnelIngof等认为孢子相与菌丝相两种形式的药敏实验结果之间有一定关系 菌丝相比孢子相的药敏试验的MIC值高，两者之间差异在3倍以内“ ；然而，G岫等进行了帚霉属、拟青霉、枝孢霉等包括菌丝相、孢子相的体外药敏实验的研究结果表明菌丝相的MIC、1c值高于孢子相的MIC、MFC值而在60对MIC值的比较中，仅有25差异在12梯度之内其余则表现出较大的差异 ：因此，孢子相与菌丝相药敏实验的关系应该进一步探讨，孢子相的丝状真菌药敏实验不能完全反映出抗真菌药物对致病性真菌的敏感性，而菌丝相药敏实验面临着菌悬液的标准化制备及其与临床疗效关系的研究。丝状真菌的体外药敏实验以NCCLSM27酵母菌药敏方案为基础，不仅可直用多量稀释法，也可应用微量法，E nelIngof等将两种方法进行丁比较，微量法与多量法的实验结果具有高度一致性，而且，菌悬液制备时通过分光光度计的应用，可增加菌悬液制备的准确性，因此，丝状真菌的药敏实验已迈上了一个新台阶，标准化的丝状真菌的药敏实验可能在不远的将来问世。3 NCCLS方案与其它新药敏实验方法随着NCCLSM27方案的广泛应用，建立在此基础上的新的药敏方法应运而生：微量法、振荡法、比色法、Etest法等，这些方法避免了NCCLS方案多量液基稀释175法的操作复杂、耗时间、耗材料的弊端使体外药敏实验向简便、节药、自动化方向发展。31 微量法众多实验表明 ，NCCLS方案推荐的多量法与微量法具有高度一致性在念珠菌的药敏实验中，AraB和I盘的一致率分别为88 87、8987，Revankar等 认为24小时肉眼判读终点结果更能提高两种方法的一致性，因为唑类药物48小时判读结果易于产生拖尾现象，可使MIC值增加128倍，造成假阳性耐药菌株的产生 J，因此，White等认为终点判读的时间是决定MIC值的主要因素 ，同时，24小时判读的药敏实验有利于与临床疗效建立密切的关系，Tomatore等研究表明，缓冲剂应用低浓度0叭65M MOPS而不是方案推荐的0 165MMOPS，能增强终点判读的准确性有利于实验室问一致性和可重复性 。Arikan等研究者建议采用振荡法，即终点判读时通过振荡的方法，与生长对照比较，抑制50或以上确定为MIC值，其实验结果增加了终点判读的准确性，可提高与M27一T方案药敏实验的一致1生1 。32 比色法最近，研究者采用氧化一还原指示剂比色分折，进行终点判读，根据指示剂的还原变色，通过比色分析，得到准确定量化的IIC值，避免了终点判读的主观性使体外药敏实验趋于自动化控制。常用的指示剂如：3一(4，5一dimethyl一2一thiazoly1)一2，5一dlphoyI一2H一一mzolium bromide (岍)、Alammar Blue。MTr为一种活细胞线粒体呼吸还原成有色产物的无色染料，产色的程度与细胞活性成正比。MIT法的主要步骤为先将受试真菌与药物按微量稀释法作用后加l_rr溶液 经412小时反应后去除上清液加终止溶解剂，根据分光光度计55Ohm嗳光度值可得出MIC结果，该技术既可用于酵母菌又可用于丝状真菌。Caney等应用了Mrr法进行药敏实验的研究，结果证明，MTF方法与标准化方案具有较高的一致性“。最近，Ahnmmr公司推出了比色法的商业化技术，TtbaUi等，应用Mammar blue比色法与标准化方案进行对比，认为具有高度的一致性，虽然在某些菌种和某些药物，24小时、48小时判读有一定误差 ：WingKin等在念珠菌实验中，AmB、F(E的比色法与标准法24小时判凄具有较高一致性，而5一FC的比色法与标准法需48小时判读才具有一致性；至于隐球菌，因为其生长缓慢，176AraB、FCZ和5一眦的比色法与标准法仍然需要72小时判读才具有一致性 J。因此，IflT法、AlnmarBlue比色法与r,JCCLS方案一样，可以用于体外药敏实验研究。33 E一 t法，目前，临床上较推崇E tesl法，即琼脂板MIC测定法，通过对琼脂板扩散法进行改进，使之商品化和易于操作，其主要改进为一含有不同抗菌药物梯度的试剂条，药物沿试剂条长轴定量连续分布成一定梯度，使用时在含咖一i640的l 5琼脂平板上橡布05M麦氏浊度的菌液，干燥15分钟后放上纸条，经培养后观察纸条上与抑菌环相一致的药物浓度为MIC值，目前可检测的药物包括5一眦、FCZ、K 、Icz、AraB，菌株包括念珠菌和臆球菌。Colom等检测了i00株病原性酵母菌，结果与NOCLS标准法之间的符合率分别为K 71、FCZ 80和ICZ84 。Wanger等研究表明，E一 t方法与NCCLS方案一致率达95 97，同时发现24小时判读结果优于48小时，而且Etest法明显地提高了对&nail耐药菌株的槛出，弥补了RP蛳一i640培养基监测AraB耐药株的不敏感的特点 Epinelhl 等。u。 对Etest法进行了改良，培养基选用Casitoile琼脂，研究结果证明比RPMI一1640培养基更能提高与NCCLS方案的一致性 J。Ynhida等采用C02孵育法，在20浓度c 情况下，通过减少氧供量，达到模拟人体内的环境的目地，使Etest法更能真实反映药物对致病菌的敏感性 ，而且，此方法可使抑制圈更加清晰、实验结果易于判读、与NCCLS药敏方案具有高度一致性。总之，Etest实验方案仍然在不断地完善，未来的发展方向是E一 方法的标准化 及与临床治疗结果的一致性，以便于更好地指导临床试验。最近，Ete 开发者公布了有关Etesl实验的质控菌株的资料，见表3，同时开展了Etest法应用于丝状真菌的研究，菌株包括曲霉、镰刀菌、根霉等，基本操作与酵母菌的Etest法相同，菌悬液的浓度通过比浊法05麦氏标准或在分9 Arikan S，秕a1 o瞄，i997，40291光光度计530 ran调整其透光百分比确定，孵育条件为35、2472小时，但是，不同的菌株要求不同的孵育条件，如镰刀菌需在35孵育2448小时，随之室温(约25)孵育2448小时；对于根霉菌属，孵育lg24小时即可因为孵育时间过长会出现生长过度。综上所述，日趋完善的N27方案使酵母菌和丝状菌的体外药敏实验迈上了一个新台阶，也为药敏实验对临床治疗的指导打下了坚实的基础，未来的抗真菌药敏试验将铪着更准确、更可靠、更简便、趋于自动化的方向发展，必将成为实验室的常规项目，指导临床治疗。参考文献1 Natioml eonnittee for CHnical kLb0mIDSI蚰daIdsVdlan aPa1 62 SanatiIf，et a1J Ch Micmbio1，1996，34(5)：12803 Wnger A，et a1 rrIicmb A鲫b 01e_m 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