课件：骨代谢异常的生物化学诊断1.ppt

第十二章 骨代谢异常的 生物化学诊断,卫生部“十一五” 规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材,主要内容,一、钙、磷、镁的代谢及调节,二、钙、磷、镁代谢紊乱,三、骨代谢异常的临床生物化学,四、骨代谢疾病的生物化学标志物与检测,第一节 钙、磷、镁的代谢及调节,一、钙、磷、镁的分布和存在形式,二、钙、磷、镁的代谢及生理功能,三、骨的生理功能,四、骨的代谢,五、激素调节,钙、磷、镁是人体重要组成物质，具有广泛的生理功能。,一、钙、磷、镁的分布和存在形式,返回节,二、钙、磷、镁的代谢及生理功能,返回节,部位：十二指肠。主要是活性VitD3调节下的主动吸收。,吸收：,排泄：,途径（1）肠道：食物中未吸收的钙和肠道分泌的钙，占人 体每日摄入钙总量的80%。 （2）肾脏：经肾排泄的钙占体内总排钙量的20%，但尿 中钙的排泄量随血液中钙浓度的变化而增 减，在调节体内钙平衡方面发挥主要作用。,1. 钙的代谢及生理功能,分 布 ：,99%的钙以羟磷灰石、无定形磷酸钙沉淀等骨盐的形式存在于骨和牙齿当中。 其余分布于体液和软组织中，以溶解状态存在。,血钙 ：,血浆中的钙称为血钙，含量：2.25-2.75mmol/L。,分 类,不扩散钙：与蛋白质结合的钙。,可扩散钙,复合钙：与柠檬酸、重碳酸根 等形成。,离子钙：Ca 2,血液pH值对血钙的影响： 酸中毒： Ca 2浓度升高。 碱中毒 ：蛋白结合钙增多， Ca 2 浓度下降。,钙的生理功能 ：,细胞内钙,细胞外钙,2. 磷的代谢及生理功能,部位：小肠，以空肠吸收最快。,吸收：,排泄：,途径（1）肠道：每日有30%由粪便排出。 （2）肾脏：主要是通过肾脏排泄，经肾排泄的磷占总排 磷量的70%，对磷排泄的调节是通过肾小管 的重吸收来完成的。,86% 贮存于骨组织、牙齿。 14% 贮存于全身各组织及体液。,分 布 ：,血 磷 ：,血浆中磷酸盐以磷酸氢盐和磷酸二氢盐形式存在。,钙磷乘积,CaP40 钙磷以骨盐形式沉积在骨组织 CaP36 妨碍骨组织钙化,Ca P=36-40（以mg/dl为单位）,磷的生理功能 ：,3. 镁的代谢及生理功能,部位：回肠。天然食物中很丰富，很少发生镁缺乏。,吸收：,排泄：,途径：主要是通过肾脏排泄。也是血浆镁水平调节的 主要器官。,分 布：,约60%以磷酸镁及碳酸镁的形式存在于骨组织中；骨骼肌中含镁约占体内总镁量的20%30%；其余约10%分布在其它组织中。 镁是细胞内仅次于钾的主要阳离子。,生理功能：,三、骨的生理功能,返回节,四、骨的代谢,骨的组成 骨组织是由骨细胞、骨纤维和骨基质组成。 骨细胞包括：成骨细胞和破骨细胞，均起源于简充质细胞。 成骨细胞的主要功能是生成骨组织的纤维和有机基质。 破骨细胞的功能则是破坏并吸收分解的骨组织。 骨纤维由胶原纤维组成，I型胶原是骨和肌肉中唯一的胶原，是组 成骨纤维的主要成分。 骨基质的干重约50是无机物即骨矿物质，钙与磷含量最多，约 99以上的钙和87以上的磷以羟磷灰石的形式构成骨盐，和胶原 纤维结合在一起使骨组织具特殊的硬度和韧性。,返回节,骨细胞结构示意图,返回节,注: 骨细胞 间骨板 骨基质 型胶原细纤维 细胞质突起 胶原细纤维束,返回节,返回节,骨的更新主要依赖于骨细胞之间的相互转化与激素的调节,返回节,五、激素调节,返回节,人体内钙、磷和镁的浓度依赖于肠道吸收、骨质的沉积 和吸收、肾脏排泌所调节。 调控这些过程的主要激素是：甲状旁腺素、 1，25-二羟 维生素D3、降钙素。,返回节,甲 状 旁 腺,PTH对细胞内钙代谢的调节,甲状旁腺激素 对肾的作用：促进磷的排出及钙的重吸收，进而降 低血磷，升高血钙。 对骨的作用：骨是最大的钙储备库，PTH总的作用 是促进溶骨，升高血钙。 对小肠的作用：PTH能升高肾25-(OH)-D3-1-羟化酶 活性，从而促进高活性的1，25- (OH)2-D的生成。促进小肠对钙和磷 的吸收。,返回节,1，25-二羟维生素D3,返回节,返回节,降 钙 素,返回节,返回节,第二节 钙、磷、镁代谢紊乱,一、钙代谢异常,二、磷代谢异常,返回章,三、镁代谢异常,一、钙代谢异常,低钙血症血钙小于2.25mmol/L以上.其病因: 低清蛋白血症 血清总钙降低，但直接检测游离钙 多正常。 慢性肾功能衰竭 使1,25-(OH)2-D3生成不足, 导致 低钙血症。 甲状旁腺功能减退 PTH分泌不足。 维生素D缺乏 吸收不良或不适当饮食，日照少。 电解质代谢紊乱 并发高磷血症，升高的血磷破坏 了钙、磷间的正常比例，使血钙降低。并发镁缺 乏，导致低钙血症。,返回节,低钙血症 患者口周麻木和四肢远端感觉异常是早期症状， 进而神经、肌肉兴奋性增加，外界刺激可引起肌 肉痉挛、手足搐搦。 维生素D缺乏引起的低血钙，儿童可导致佝偻病。 低血钙时还可出现白内障、皮肤干燥、毛发枯 萎、指甲易碎、出牙异常，CT检查头颅有基底结 钙化。,返回节,高钙血症血钙大于2.75mmol/L时,系多种原因 引起的综合征。常见于： 钙溢出进入细胞外液如癌肿时骨矿物质过 度被吸收 肾对钙重吸收增加如应用噻嗪类药物 肠道对钙吸收增加维生素D中毒 骨骼的重吸收增加固定不能活动 原发性甲状旁腺功能亢进，PTH过度分泌,返回节,高钙血症最常见的原因: 原发性甲状旁腺功能亢进、恶性肿瘤占所有 高钙血症的90%95%。 甲状旁腺机能亢进，实验室检查: 除血钙增高外，尚有尿钙高、血磷低、碱性磷 酸酶升高。 骨病变可有骨质疏松、纤维囊性骨炎；肾脏有 肾结石等。 恶性肿瘤常具有不同的局部症状及体征，如乳 腺癌病人，乳房可有肿块、硬结等。,返回节,二、磷代谢异常,低磷血症 血清无机磷浓度低于0.81mmol/L。 血磷浓度在0.480.77mmol/L之间为中等偏 低，除慢性骨软化症或佝偻病所致者外，无 临床症状。 血磷低于0.48mmol/L，才会出现临床症状。 常见的低磷血症病因有： 磷向细胞内转移 肾磷酸盐阈值降低 肠道磷酸盐的吸收减少 细胞外磷酸盐丢失,返回节,高磷血症指血清无机磷浓度高于1.45 mmol/L。 常见引起高磷血症的原因有： 肾排泌磷酸盐能力下降 磷酸盐摄入过多 细胞内磷酸盐大量转运出,返回节,低镁血症 缺镁的主要表现是神经-肌肉障碍和精神与行动的 异常，如乏力、衰弱感、体温调节不良。严重时可 有神经过敏、震颤、搐搦、肌肉痉挛、眼颤以及吞 咽困难等。 镁缺乏通常因胃肠道及肾脏的丢失 胃肠道病症 肾脏丢失,三、镁代谢异常,返回节,返回节,镁异常与代谢性骨病,镁能从羟磷灰石中置换出钙，故镁能够影响骨的代谢。 骨镁含量的改变可能会造成某些骨性疾病，绝经期妇 女的骨质疏松患者中有60%发生了镁吸收不良。 高镁可影响成骨作用，骨镁升高，矿化过程减慢，可 能发生骨营养不良。 低镁或高镁血症的病人，骨镁含量明显与血浆镁相关， 如透析病人骨镁含量增加，这是由血浆镁的增加所致。,返回节,第三节 骨代谢异常的临床生物化学,一、骨的代谢,返回章,二、骨细胞凋亡与骨代谢紊乱,骨细胞凋亡与骨代谢紊乱,骨细胞凋亡：即骨细胞程序性死亡，是机体为维持内 环境稳定，由基因控制的骨细胞自主的 有序性死亡。,细胞凋亡：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序 而导致的细胞死亡过程。是一个由基因调 控的细胞主动结束生命的过程。,细胞凋亡与细胞坏死的区别,坏死 凋亡,1.性质,2.诱导因素,强烈刺激，随机发生,较弱刺激，非随机发生,3.生化特点,4.形态变化,6.DNA电泳,5.炎症反应,7.凋亡小体,8.基因调控,被动过程，无新蛋白合成，不耗能,主动过程，有新蛋白合成，耗能,细胞肿胀，结构全面溶解、破坏,细胞皱缩，胞膜及细胞器相对完整，核固缩,弥散性降解，电泳呈均一DNA片状,DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带,溶酶体破裂，局部炎症反应,溶酶体相对完整，局部无炎症反应,有,病理性，非特异性,生理性或病理性，特异性,无,有,无,在成骨和破骨过程中均存在细胞凋亡 破骨细胞凋亡与骨转换进程密切相关，凋亡过早或过晚 均可导致骨质疏松。促进破骨细胞凋亡或解除阻止破骨细胞 凋亡的因素有利于减少骨吸收。 目前认为软骨发育不全性保儒症、骨关节病、甲状旁腺 功能紊乱亢进、Paget 病、绝经后骨质疏松、骨肿瘤等溶骨 性破坏等骨代谢疾病均有骨的细胞凋亡参与。,第四节 骨代谢疾病的生物化学标志物与检测,一、骨形成的标志物与检测 二、骨吸收的标志物与检测 三、有关骨矿物生物化学检测 四、骨代谢调节激素测定,骨代谢的生化检测可以反映骨形成和骨吸收的动态信息，能显示骨代谢的快速改变，其变化显著早于骨密度的改变，因而对骨质疏松和其他代谢性骨病的诊断具有重要意义。 反映骨代谢的常用生化指标有骨形成标志物和骨吸收标志物二类。,一、反映骨形成的标志物 骨钙素 骨性碱性磷酸酶 型胶原前肽,返回节,骨钙素是含49个氨基酸，分子量5669的小蛋白，为人骨中主要的和最多的非胶原蛋白，占总蛋白的1%。 骨钙素是1, 25- (OH)2-D3刺激下由成骨细胞合成， 其中50%进入血循环。故血清骨钙素水平基本上能够 反映近期成骨细胞合成骨钙素和骨形成的情况。 骨钙素主要生理功能：是维持骨的正常钙化速度， 抑制异常羟基磷灰石结晶形成，抑制软骨狂欢速度。,返回节,1、骨 钙 素,（1）骨钙素的检测,检测方法：RIA、双位免疫放射法（IRMA）、ELISAS,目前临床上最常用的测定方法。,参考范围：213 g/L,（2）骨钙素的临床评价,是反映骨代谢状态的一个特异和灵敏的指标，可直接反映成骨 细胞活性和骨形成情况，并对观察药物治疗前后的动态变化有 一定的参考价值。 升高：见于儿童生长期、肾性营养不良、畸形性骨炎、甲亢等。 降低：见于甲状旁腺功能减退、甲状腺功能减退、肝病等。,注意： 骨钙素释放入血循环后，被肾迅速地清除，循环中的骨钙素半寿期仅为5分钟左右，故血清骨钙素水平基本上能够反映近期骨细胞合成骨钙素和骨形成的情况。,返回节,2、骨性碱性磷酸酶,碱性磷酸酶 ALP存在于骨、肝肠、肾和胎盘等许多组织。 成骨细胞中ALP活性高，当成骨细胞活跃，可见血清ALP活性增高。故ALP活性可作为骨更新的指标。 ALP还可由胆小管细胞产生,可作为胆汁郁积的标志。 因此检测血清总ALP活性评价骨生长，特异性和敏感性均不理想。,骨性碱性磷酸酶（B-ALP） B-ALP在血清中比骨钙素更稳定，血清中的半寿期为12d，并且不受昼夜变化的影响。因此，血清骨性碱性磷酸酶在反映成骨细胞活性和骨形成上则有较高特异性，并优于骨钙素。,（1）B-ALP的检测,先识别或分离出BALP，再测定其碱性磷酸酶的活性。 目前最好的方法是用免疫放射法(IRMA)测定BALP。 IRMA法定量检测骨ALP可作为筛选试验，高值标本须用电泳法证实除去肝ALP干扰，检测骨ALP过低标本时，以电泳法为首选。 近来建立了对BALP特异性很强的单克隆抗体的免疫分 析法，具有高度的特异性和敏感性，而且操作简便， 被认为是目前鉴别和定量分析BALP的最佳方法。,（2） B-ALP的临床评价,增高见于Pagets病、修复活跃的骨质疏松、甲状腺毒症、甲状旁腺功能亢进、骨质软化症、佝偻病、骨营养障碍、骨质溶解转移、肢端肥大症以及其他增加骨形成的病症。 不仅用于骨病早期诊断，而且对疗效的评价和预后的判断均有重要价值。,型胶原是由成骨细胞的前体细胞合成，含N-和C-端延伸段。这些延伸段又称前肽，在形成纤维和释放入血时从型胶原上断裂下来。现多检测C-端前肽（PICP）。,返回节,3、 型胶原前肽,前体细胞型前胶原(含N-和C-端延伸段) 一系列修饰(羟基化、糖基化修饰 ) 形成三螺旋结构 去掉N-和C-端前肽原胶原成熟的胶原纤维,共价结合或交联,形 成,型胶原也是其他组织的主要基质，故型胶原前肽 评估骨形成的敏感性和特异性不如骨钙素和B-ALP。 在评价体内1,25-(OH)2-D3代谢紊乱及替代治疗的疗效 上，型胶原前肽则优于骨钙素和B-ALP。 增高见于儿童发育期，妊娠最后3个月、骨肿瘤、畸形 性骨炎、酒精性肝炎、肺纤维化等。,（1） 型胶原前肽的检测,检测方法：RIA、电化学发光免疫分析,（2） 型胶原前肽的临床评价,二、反映骨吸收的标志物 抗酒石酸酸性磷酸酶 尿羟脯氨酸 型胶原交联降解产物,血浆抗酒石酸酸性磷酸酶主要存在于破骨细胞。当骨吸收时，由破骨细胞产生并分泌入血，能反映破骨细胞活性和骨吸收情况。,返回节,1、抗酒石酸酸性磷酸酶,（1） 抗酒石酸酸性磷酸酶的检测,检测方法：其活性检测有许多方法，但对破骨细胞同工 酶没有特异性。目前免疫法中应用的抗体不 能完全特异性识别骨性TRAP。,（2）抗酒石酸酸性磷酸酶的临床评价,参考范围：男女：61-300g/L ， 绝经后女性：129-348g/L, 儿童：400-710 g/L。（ELISA 供参考）,增高见于原发性甲亢、慢性肾功能不全、畸形性骨炎、 骨转移癌、卵巢切除术后、高转换率的骨质疏松患者 降低见于骨吸收降低的疾病，如甲状旁腺功能降低。,尿羟脯氨酸是体内胶原代谢的终产物之一，可来自骨胶原以及骨以外的各种胶原组织及饮食中胶原。 易受各种疾病或其他因素包括饮食的干扰。 因此，对骨更新或骨吸收不特异，不是骨更新或骨吸收的常规标志物。,2、尿羟脯氨酸,返回节,3、型胶原交联降解产物,骨的有机基质中胶原交联90%为型胶原。 骨吸收期间型胶原被水解，其交联分解产物释放入血 并从尿中排除。检测尿脱氧吡啶酚和(或)吡啶酚，或测定交 联区的C-和N-端肽，可作为反映骨吸收的指标。,脱氧吡啶酚和吡啶酚是型胶原分子之间构成胶原 纤维的交联物，起稳定胶原链的作用。 是两种天然的不能被还原的交联： 脱氧吡啶酚：由两个羟赖氨酸侧链和一个赖氨酸侧链反应生成。 吡啶酚：由三个羟赖氨酸侧链反应生成的。 骨是两种吡啶酚的主要来源，故这两种吡啶酚测定可用于评价骨吸收。,(1)脱氧吡啶酚和吡啶酚,脱氧吡啶酚、吡啶酚是反映骨胶原降解和骨吸收的最特异和灵敏的生化指标之一，脱氧吡啶酚表现出更高的骨吸收特异性和灵敏度，其原因是： 它是由胶原自然形成的，非生物合成。 从尿中排除前不被代谢。 骨是其主要来源。 仅来源于天然基质的降解产物，不受饮食影响。,测定：高效液相色谱（HPLC）和免疫法,是型胶原末端通过吡啶酚类结构连接起来的肽链部分。 是一种骨吸收的指标，与吡啶酚和脱氧吡啶酚一样具有较好特异性，不受饮食等干扰。,返回节,(2) 型胶原交联N末端肽和C末端肽,测定：免疫法,吡啶酚和交联区端肽水平的评价 已用于骨质疏松、Paget病、其他代谢性骨病、原发性甲状旁腺功能亢进和甲状腺功能亢进、以及其他伴有骨吸收增加的疾病的诊断或评价。,吡啶酚和脱氧吡啶酚测定 HPLC法：用HPLC-荧光检测法测定。 免疫法：用等分子交叉反应法检测吡啶酚。 竞争性单克隆抗体ELISA法测定脱氧吡啶酚。 C-端肽和N-端肽测定 ELISA法 抗酒石酸酸性磷酸酶测定 免疫法 尿羟脯氨酸测定 离子交换色谱反相HPLC法。,三、有关骨矿物生物化学检测 血清钙检测 血清磷检测 血清镁检测,1、血清钙测定,包括游离钙和总钙的测定,（1）血清总钙测定： IFCC推荐：决定性方法为放射性核素稀释质谱法 参考方法为原子吸收分光光度法 我国推荐：常规方法为邻甲酚酞络合酮法 原理：邻甲酚酞络合酮与钙在碱性环境下 生成紫红色 鳌合物，在570-580nm 波长测吸光度值。,（2）血清游离钙测定： 参考方法为离子选择性电极法（ISE）。 目前应用最多，此方法简便、快速、重复性好，正确和敏感性高。,2、血清磷测定,决定性方法为放射性核素稀释质谱法 WHO推荐的常规方法为比色法 我国推荐的常规方法为还原钼蓝法（硫酸亚铁或米吐尔为还原剂） 目前常用方法为紫外分光光度法,3、血清镁测定,（1）血清总镁测定： 决定性方法为放射性核素稀释质谱法 参考方法为原子吸收分光光度法 我国推荐常规方法为甲基麝香草酚蓝比色法、钙镁试剂法,钙镁试剂是一种金属色原指示剂，在碱性溶液中与镁结合形成紫色复合物检测。 甲基麝香草酚蓝法：MTB与镁形成兰色复合物。 加入钙螯合剂EGTA可减少钙的干扰，减少蛋白质及血脂的干扰。,（2）血清游离镁测定： 主要方法为离子选择性电极法（ISE）和酶法,四、骨代谢调节激素测定 甲状旁腺素检测 维生素D检测 降钙素检测,1、甲状旁腺素测定,可测定C端、中段和完整分子。 国外：免疫放射量度分析（IRMA）法、ICLA法测完整分子 国内：RIA法,ELISA法是新近发展起来的方法，具有快速、灵敏、无同位素污染的优点, 该法最小检测量为2pgml，批内及批间CV分别为2.72.9和7.98.6。回收率为9394。,2、维生素D测定,1,25-二羟维生素D3是反映维生素D状况的最佳指标，以 放射受体法（RRA）、RIA法最为普遍。,3、降钙素测定,目前两点免疫法灵敏度更高。,4、甲状旁腺相关蛋白测定,竞争性免疫法 固定抗PTHrP抗体的亲和色谱法反相色谱法,第五节 骨代谢疾病的临床生物化学,一、骨质疏松症 二、佝偻病和骨质软化症 三、Pagets病 四、肾性骨营养障碍,骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种因多种原因引起的骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等成比例地不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增