课件：兽医药理学实验.ppt

兽医药理学实验,河南科技大学动物科技学院 主讲：赵振升 白东英 王国永,动物医学、动植检专业,本课程实验内容,实验一 药理实验基础知识 实验二 药物的剂量与剂型对药物效应的影响 实验三 毛果芸香碱与阿托品对瞳孔及对光反射的影响 实验四 药物急性半数致死量的测定 实验五 肝脏损伤对药物作用的影响 实验六 药物敏感性实验 实验七 磺胺类药物内服给药后的血中药物浓度测定 实验八 药物对家兔的利尿作用的影响 实验九 有机磷酸酯类中毒及解救,实验一 药理实验基础知识,目的 掌握基本操作，锻炼动手、动脑能力； 更好地掌握药理学基本理论知识； 培养科学思维,基本要求 实验前：预习实验内容并复习相关理论知识； 实验时 实验器材要妥善保管； 实验操作按步骤进行，仔细观察实验中出现的现象，实事求是地做好记录； 注意节约实验药品； 维持良好的课堂纪律。 实验后 各组同学将实验动物处死，实验台擦干净，将实验方盘送回准备室； 值日生搞好实验室卫生，将死亡动物送至指定场所； 书写实验报告。,实验报告的书写 题目 目的 原理 材料：实验动物，器材，药品 方法：用自己的语言简单扼要描述出来； 结果：要求真实、清楚； 讨论：将实验结果进行比较、分析；实验中有哪些不足之处；结果异常或失败的原因； 结论：将实验结果进行归纳总结，应带有提示性质。,实验设计基本原则 随机原则 使每一实验对象都有同等的机会抽到实验组或对照组中，除处理因素外其他因素尽可能均衡一致，从而抵消非实验因素的影响。 对照原则 组间对照：阴性对照，阳性对照，同因素不同水平对照； 自身前后对照 重复原则,实验动物 动物的选择 小白鼠：适用于需大量动物的实验，如某些药物的筛选，半数致死量的测定。也较适用于避孕药实验、抗炎镇痛药实验、中枢神经系统药实验、抗肿瘤药及抗衰老药实验等。 大白鼠：比较适用于抗炎药物实验，血压测定、利胆、利尿药实验，也可用于进行亚急性和慢性毒性实验。,实验动物 动物的选择 豚鼠：因其对组胺敏感，并易于致敏，故常被选用于抗过敏药、平喘药和抗组胺药的实验。也常用于离体心脏、心房、肠管实验。又因它对结核敏感，常用于抗结核病药的实验。 家兔：常用于观察研究脑电生理作用，药物对小肠的作用。由于家兔体温变化敏感，也常用于体温实验，用于热原检查。 狗：狗是记录血压，呼吸最常用的大动物。还可利用狗做成胃瘘、肠瘘，以观察药物对胃肠蠕动和分泌的影响。在进行慢性毒性实验时，也常采用狗。,动物捉拿及固定方法 小白鼠 右手提起鼠尾, 左手拇指和食指捏住双耳及头部皮肤，无名指、小指和掌心夹其背部皮肤及尾部,便可将小鼠完全固定。如图1。 单手捉持，用拇指和食指抓住小鼠尾巴，用小指、无名指和手掌压住尾根部，再用腾出的拇指、食指及中指抓住鼠双耳及头部皮肤而固定。如图2。,图2,图1,动物捉拿及固定方法 豚鼠 豚鼠性情温和不咬人，用手握住躯干即可。 家兔 可用一手抓住家兔颈背部皮肤，将兔提起，另一手托其臀部，使兔呈坐位姿势。在进行仰位手术操作时，可用绳带将其四肢仰位捆绑在兔手术台上。头部用兔头固定夹固定。,动物的给药方法 小白鼠 灌胃法（i.g.）：以左手固定小鼠后，使其腹部朝上，颈部伸直。右手持配有灌胃针头的注射器，自口角插入口腔，再从舌面沿上腭进入食道。小鼠灌胃容量一般为0.1-0.3m110g。,动物的给药方法 小白鼠 腹腔注射(i.p.)：以左手固定小鼠，方法同灌胃，右手持注射器，取30度角将针头从下腹部向头端刺入腹腔。进针部位不宜过高，刺入不宜太深，以免伤及内脏。小鼠腹腔注射量一般为0.1-0.3mll0g。,肌肉注射（i.m.）：小鼠因肌肉较少，很少采用肌肉注射，若有需要可注射于股部肌肉，多选后腿上部外侧，一处注射量不超过0.1mL 。,动物的给药方法 小白鼠 皮下注射(s.c.)：用左手固定小鼠后，右手持注射器于拇指和食指捏起的皮肤处进针即可。 静脉注射(i.v.)：将小鼠置于特制的固定筒内或倒置的大漏斗下，让其尾部露出。用酒精或二甲苯涂擦尾部，或将鼠尾在50C热水中浸泡半分钟使血管扩张。左手拉尾端，右手持注射器将针头刺入尾静脉，推入药液。,动物的给药方法 家兔 灌胃：需两人合作进行。一人取坐位用两腿夹持兔身，左手握家兔双耳，右手抓住两前肢。另一人将木制开口器横插家兔口内，压住舌头并固定之。取8号导尿管从开口器中部小孔插入食道。插管时如误入气管会出现动物的挣扎和呼吸困难。也可将导尿管的外端浸入水中，如有气泡吹出，表示插在气管内，此时应拔管重插。当判明导尿管在食道以内后，用注射器接通导尿管将药液推入。,动物的给药方法 家兔 皮下、肌肉、腹腔注射：给药方法基本上同小鼠，唯针头可稍大，给药量可稍多。皮下与肌内为0.5-1.0/mg，腹腔为1.0-5.0ml/mg 静脉注射：将家兔置固定箱内，拨去耳壳外缘的毛，选择一条比较明显的耳缘静脉（兔耳外缘的血管为静脉，中央的血管为动脉，如图） ，用酒精棉球涂擦皮肤，使血管显露。用左手拇指和中指捏住兔的耳尖部，食指垫在兔耳注射处的下面，右手持注射器，将针头从近耳尖处刺入，当确认针头在血管中后，将药液推入。,实验二 药物的剂量与剂型对药物效应的影响,实验目的 观察不同剂型与剂量对药物效应的影响。 实验材料 l.0ml注射器、针头、小鼠灌胃针头、烧杯、普通天平、3.5硫酸镁溶液（注射液和口服溶液）,观察指标 动物活动增加情况、呼吸急促、反射亢进、震颤、惊厥及死亡时间、炭末推进率等。 实验方法 取禁食12h的昆明种小鼠3只，称重，分别标为对照组、灌胃组和腹腔注射组按以下给药： A：对照组：灌胃给生理盐水0.2ml/10g； B：灌胃组：灌胃给3.5硫酸镁溶液0.2ml/10g； C：腹腔注射组：腹腔注射给3.5硫酸镁溶液0.2ml/10g。,给药后注意观察动物的活动情况，是否有肌肉松弛的表现。 15min后每只小鼠均灌胃给予5%炭末阿拉伯胶混悬液0.2ml。 炭末灌胃后15min，将小鼠脱臼处死，剖开腹腔，取出胃肠道。剪去附着在肠管上的肠系膜,将肠管不加牵引地轻轻地平铺在玻璃板上(玻璃板上滴少许盐水)。以幽门为起点,测量炭末在肠管内的移动距离和小肠(自幽门至回盲部)的全长,计算每只小鼠炭末的移动距离占小肠全长百分率，比较3组动物的活动状况和胃肠炭末推进率有何不同。,实验结果 实验结果填入下表中,不同剂型对药物效应的影响,思考讨论题 灌胃和腹腔注射给硫酸镁的效应有哪些不同？为什么？ 本次实验结果对临床用药有何提示？,实验三 毛果芸香碱与阿托品对瞳孔 及对光反射的影响,目的 了解毛果芸香碱的副交感神经节后拟胆碱作用和阿托品的对抗作用。 材料 兔子只，0.05%硫酸阿托品注射液,0.1%盐酸肾上腺素注液,0.2%硝酸毛果芸香碱注射液,方法 取兔放于兔固定箱内固定，避免阳光直射眼睛，用毛剪剪去兔两眼睫毛，然后用瞳孔量尺测量瞳孔大小，连续三次，取平均值。 在兔左眼滴入.2%毛果芸香碱3滴，滴药时用姆指和食指将下眼睑提起,使成囊状,再用中指压住鼻泪管开口处,防止药液流入鼻泪管而不起作用，再用右手滴入药液。15分钟后再测量瞳孔大小，连续三次，取平均值，并进行比较。 滴入毛果芸香碱20分钟后，分别在两眼滴入0.1%肾上腺素3滴，15分钟后测量两瞳孔大小，连续3次，取平均值并进行比较。 滴入肾上腺素15分钟后，分别于两眼滴入0.05%硫酸阿托品注射液3滴，15分钟后观察两眼瞳孔变化，并测量其大小，连续3次，并取平均值,记录,讨论题 从实验结果中如何说明药物的协同作用和拮抗作用？,实验四 药物急性半数致死量的测定,实验目的 通过实验，学习测定药物的半数致死量的方法、步骤和计算过程，了解测定药物半数致死量的意义。 实验要求 半数致死量（LD50）是衡量药物毒性大小的重要标志， LD50表示能使全部实验动物死亡半数的药物剂量，是以动物死亡或存活作为质反应标志。 LD50小说明药物的毒性大， LD50大表明药物毒性小。,实验器材与药物 注射器，乙酰甲喹 试验方法 预备试验 取雏鸡20只，以5只为1组，分成4组。分别灌服不同剂量 的药物，连续观察24 h，出现中毒症状并记录死亡数。找出 引起0%及100%死亡率剂量的所在范围。预试验组中给予雏鸡 500 mg/Kg剂量5只雏鸡全部死亡，而给予100 mg/Kg剂量组 的5只雏鸡全部存活。通过预试验结果按照下面公式算出剂 量间的等比值（1：r）,r0.7,式中N为分组组数，Dm是估计100%死亡的致死量，Dn是估 计0%死亡的致死量，r为比值。 计算各组剂量： 第一组 500 mg/kg 第二组 350 mg/kg 第三组 245 mg/kg 第四组 171.5 mg/kg 第五组 120.05 mg/kg 第六组 空白对照组,正式试验 一个班分两大组，每大组用50只雏鸡（50-60g）进行急性 LD50测定。每大组将雏鸡50只分为5组，每组10只，按上述 计算的剂量口服灌服给药，每只给1 mL。空白组不给药。 实验记录,计算 1. LD50的计算按综合计算法公式计算 2计算logLD50的标准误S 3. 计算95%置信区界（FL） 上述公式中： Xm为最大死亡率组剂量对数；i为组距（相邻 两组剂量比值的对数）；P为各组死亡率总和（用小数表 示）；X50为logLD50；Xi相邻对数剂量差。,如果试验结果最高死亡率在80100%之间，最低死亡率在 200%之间，可用下列公式求得校正值： LD50=log-1Xm-i(p-(3-Pm-Pn)/4 式中：Pm最高死亡量组 Pn最低死亡量组,实验五 肝脏损伤对药物作用的影响,实验目的 通过实验，观察肝损伤后对药物作用的影响。 实验目的 肝脏是药物代谢的主要器官，而药物的代谢主要靠酶的催化。在肝细 胞内有专门催化药物等外源性化学物质代谢的微粒体酶，简称药酶。四 氯化碳是一种对肝细胞有严重毒害作用的化学物质，可引起中毒性肝 炎，使肝脏对药物的代谢能力降低。本实验用四氯化碳损害小白鼠的肝 脏，使肝药酶活性受到抑制，从而减缓对硫喷妥钠的代谢，使麻醉时间 延长。,实验仪器、设备 仪器：注射器，针头，天平，鼠笼。 药物：四氯化碳、硫喷妥钠 实验内容 给健康小白鼠注射四氯化碳（0.1 mL/10g)，造成肝损伤，后用0.3%硫喷妥钠注射(0.15 mL/10g)，与健康小白鼠对照， 比较它们麻醉出现及维持的时间的不同； 解剖所有小白鼠，分别观察它们肝和肾的病理变化，并与健康小白鼠比较。,实验记录 肝脏损伤对药物作用的影响,注意事项 “麻醉开始时间“为小鼠从腹腔注射硫喷妥钠溶液后至翻正反射消失时间；“麻醉消失时间”为从翻正反射消失至翻正反射恢复的时间。,实验六 药物敏感性实验,学习内容 药物敏感实验纸片法 定量药敏实验试管二倍稀释法 学习要求 掌握两种药物敏感实验的原理、方法及注意事项。,抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）： 用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。通常根据MIC结合常用剂量时体内该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗生素敏感或耐药的界限，给出S（敏感）、I（中介）、R（耐药）等定性的结果，方便临床用药。 检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理用药。 用于流行病学调查及院内感染的监控，控制和预防耐药菌株的流行。 为经验用药提供参考依据。 方法：扩散法（纸片法）、稀释法（有琼脂稀释法和液体稀释法）,药敏纸片的人工制作 定性滤纸用打孔器打成直径6mm的圆片，每100片放入一小瓶中，160干热灭菌1-2小时，或用高压灭菌（6.8kg30min）后在60条件下烘干。（此应提前做好） 抗菌药物的浓度（指有效药物浓度） 青霉素 200U/ml 其它抗菌药物 1000ug/ml 磺胺类药物10mg/ml 中草药制剂 1g/ml 庆大霉素4万单位/ml，稀释为1000单位/ml。 （临床上可按照药品使用说明书，如上面标明5克本品可拌50千克饲料，其换算方法为l克本品可拌10千克饲料，也就是1克本品拌l0000克饲料，相当于药品浓度为l克本品加l0000毫升蒸馏水。）,用无菌操作法将欲测的抗菌药物溶液1ml，加入100片纸片中，置冰箱内12小时，用下列方法烘干： 培养皿烘干法：将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37的温箱内保持2-3小时即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。 将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用。并用标准敏感菌株做敏感性实验，记录抑菌环的直径。 干燥的药敏纸片可保存6个月。 使用前用标准的敏感菌株做药物敏感实验，若抑菌环比原来小，则表明该纸片已失效。,纸片法 每组约7-8个平皿（每人1个），每个平皿约20毫升琼脂培养基，即约200ml。按照每组500毫升琼脂培养基、100毫升肉汤培养基准备。每平皿约4张纸片，每班约240张以上。 将琼脂培养基熔融后，每个平皿倒入约20毫升，晾干后，用玻棒蘸含菌棉球（玻棒、棉球均事先消毒）涂抹均匀后晾干。 用镊子夹纸片，每个平皿贴4张纸片，要使纸片全部紧贴培养基。为保证均匀，可于平皿背部划出贴纸片点。 36摄氏度培养过夜。测量宽度。,试管稀释法 每组2排试管，每排10支。共80支。 将庆大霉素用肉汤稀释液成64微克/毫升。每班20毫升即可。 挑选10支无菌试管编号110。 无菌加入1.0毫升肉汤至第2到10管内。 将64微克/毫升庆大霉素液体，分别加1.0毫升至第1、2管，将第2管混合后取1.0毫升至第3管，依次至第9管，再从第9管取1.0毫升丢去，第10管不加抗生素作阳性对照。,试管稀释法 另准备肉汤管不加抗生素、细菌作阴性对照。 第110管分别加入已增菌6小时的细菌浓度约为105-106cfu/ml菌液1.0毫升（细菌菌龄为16-18小时，McFarland No 0.5管 细菌浓度1.5108cfu/ml，然后用用肉汤1：200稀释）。 培养和结果判读：35培养16-24小时，肉眼观察有无细菌生长。阳性可见混浊生长，阴性可见澄清。 最终各试管庆大霉素浓度： 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0 微克/毫升,实验七 磺胺类药物内服给药后的血中药物浓度测定,目的 了解磺胺嘧啶非血管内一次给药后血药浓度随时间变化的规律。 原理 已知磺胺嘧啶等磺胺类药物在酸性环境下其苯环上的氨基（NH2）将被离子化而生成铵类化合物（NH3+）。后者与亚硝酸钠反应可发生重氮化反应进而生成重氮盐（NN+）。该化合物在碱性条件下可与麝香草酚生成橙黄色化合物。在525nm波长下比色，其光密度与磺胺嘧啶的浓度成正比。,根据上述原理,在给受试家兔一次静脉注射一定剂量的磺胺嘧啶后,于不同时间点采集其静脉血样,采用比色法对各样品中磺胺嘧啶的血药浓度进行定量分析,并以血药浓度对相应时间作图,从而获得磺胺嘧啶的静脉给药后的药时曲。,动物 3kg左右家兔一只 药品 20磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、7.5三氯醋酸、0.1SD标准液、0.5亚硝酸钠、0.5麝香草酚（用20NaOH配制）、1000u/mL肝素生理盐水、3戊巴比妥钠、蒸馏水。 器材 721分光光度计、离心机、磅秤、手术器械、动脉夹、尼龙插管（或玻璃插管、硅胶管）、兔手术台、注射器（5mL）及针头、移液器（0.011mL）、吸头、试管、离心管、试管架、玻璃记号笔、药棉、纱布、计算机。,方法与步骤 血中药物浓度测定 麻醉：全麻或局麻均可。取兔一只（实验前禁食12小时不禁水），记录体重和性别，耳缘静脉注射3戊巴比妥钠0.81.0 mL/kg麻醉，仰位固定于兔手术台上。 手术：颈部手术区剪毛，切皮约6cm左右，钝性分离皮下组织和肌肉，气管插管，分离出颈总动脉约23 cm左右，在其下穿两根细线，结扎远心端，保留近心端。 耳缘静脉注射1000u/mL肝素1 mL/kg。 插管：用动脉夹夹住动脉近心端，再于两线中间的一段动脉上剪一“V”型切口，插入尼龙管，用线结扎牢固，以备取血用。,方法与步骤 血中药物浓度测定 取血：打开动脉夹放取空白血样0.4mL，分别放入1号管（空白管）和2号管（标准管）各0.2mL摇匀静置。而后腹腔注射20SD 1.5mL/kg，分别于注射后5、15、30、45、75、120、180、240、300分钟时由动脉取血0.2mL加到含有7.5三氯醋酸2.7mL的试管中摇匀。标准管加入0.1SD标准液0.1mL，其余各管加蒸馏水0.1mL摇匀。 显色：将上述各管离心5分钟（1500-2000转/分），取上清液1.5mL，加0.5亚硝酸钠0.5mL，摇匀后，再加入0.5麝香草酚1mL后溶液为橙色。 测定：于分光光度计在525nm波长下测定各样品管的光密度值。 计算血中药物浓度：根据同一种溶液浓度与光密度成正比的原理，可用空白血标准管浓度及其光密度值求算出样品管的磺胺药物浓度。,结果与处理 将所得数据用计算机软件绘制药物的药时曲线。 注意事项 每次取血前要先将插管中的残血放掉。 每吸取一个血样时，必须更换吸量管，若只用一支吸量管时必须将其中的残液用生理盐水冲净。 将血样加到三氯醋酸试管中应立即摇匀，否则易出现血凝块。,实验八 药物对家兔的利尿作用的影响,实验目的 根据尿液的多少，了解几种利尿药的利尿作用 实验原理 尿液的生成过程受多种因素的影响。本实验通过改变某些影响肾小球滤过或肾小管、集合管重吸收的因素，观察对尿液的影响。,实验仪器、设备 器材：兔手术台，哺乳动物手术器械一套，膀胱套管，记滴器，培养皿。 药物：20%乌拉坦，生理盐水，抗利尿素，50%葡萄糖，20%明胶，速尿。 实验内容 兔的麻醉 用20%乌拉坦溶液（1 g/Kg)沿耳缘静脉注射麻醉后，将兔仰卧固定于手术台上，剪下腹部的毛。,尿液收集方法 从耻骨联合向上沿正中线作约4cm长的皮肤切口，再沿腹白线剪开腹壁及腹膜，将膀胱翻至体外（勿使肠管外泄，以免血压下降）。在膀胱底部找到两侧输尿管，认清两侧输尿管在膀胱的开口部分。小心地在两侧输尿管下方穿一棉线，将膀胱上翻，结扎尿道。再在膀胱顶部血管较少的地方做一荷包缝合，中心作一小切口，插入膀胱插管或塑料管，插管口需对准两输尿管出口，收缩缝线结扎固定，导管的另一端连至计数器。轻轻将膀胱连同膀胱导管送入腹腔，腹部切口处用止血钳轻轻夹住，并用温生理盐水纱布覆盖手术部位。,观察项目 记录正常的尿量。 静脉注射10 mL/kg生理盐水，观察尿量变化，同记录3分钟并于23分后开始下一步实验。 静脉注射抗利尿素2单位，观察尿量变化。 静脉快速注射50%葡萄糖（4 mL/kg），观察尿量变化。 静脉注射预先加热的37明胶1015 mL，观察尿量变化 静脉注射速尿0.5 mL，观察尿量变化。 静脉注射1：10 000盐酸肾上腺素0.20.3 mL，观察尿量变化。,实验记录 记录用药前后家兔的泌尿量,实验九 有机磷酸酯类中毒及解救,实验目的 有机磷酸酯类中毒的症状和血液胆碱酯酶活力的抑制情况。 握较阿托品和解磷定解救有机磷酸酯类中毒的作用原理。,实验原理 有机磷酸酯类中毒后，胆碱酯酶(chE)活性受到抑制，失去水解乙酰胆碱(Ach)的能力，Ach在体内蓄积，引起一系列中毒症状(M样、N样和中枢神经系统症状)。抗胆碱药阿托品能拮抗Ach的作用，解除有机磷酸酯类中毒M样症状。胆碱酯酶复活药解磷定能使被有机磷酸酯类抑制的胆碱酯酶活性恢复，对M及N样症状有效。两药合用可提高解救效果。,实验材料 实验动物：家兔，2.53.0kg 仪器设备：恒温水浴，分光光度计，试管架，中