课件：疾病产生的分子基础bbbpowerpointbpresenta.ppt

第十一章 Chapter11 疾病产生的分子基础 Molecular Basis of Diseases Formation,基因结构与表达异常与疾病,人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等的发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。,人体内蛋白质分子结构和功能的异常是疾病的发生和发展的主要原因 。,基因结构与表达异常与疾病,细胞微环境的变化，包括基因甲基化的变异以及各种特定基因表达的异常都和疾病发生有关。越来越多的证据显示基因表达的异常将导致各种疾病的发生，尤其是肿瘤形成。,基因结构与表达异常与疾病,人的基因组中有相当一部分基因，甚至染色体片段，在精子或卵细胞形成过程中，会因某种结构修饰而不能表达，称为基因印迹（genetic imprinting）。这种在生物进化中形成的、有规律而又受控的基因失活是机体中基因表达调节的一种重要方式。基因印迹的异常往往会导致多种遗传性疾病。,一、基因结构与表达异常与疾病发生,1基因结构改变,2细胞间信号异常,3 细胞内因素,(一) 基因突变的多种类型,点突变是单个碱基的改变 缺失是一个或多个核苷酸的丢失 插入是一个或多个核苷酸的增加 倒位是一段核苷酸序列方向倒转 基因突变还分为配子突变与体细胞突变 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变,基因突变,由于体内外各种因素改变了某基因特定的DNA序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一级结构发生改变，改变了基因结构；其分子机制可以是替换、插入或缺失，因而产生不同的突变类型。,基因突变的类型,点突变:单个碱基的改变 在基因一级结构的某个位点上，一种碱基被另一种碱基取代。,分为： 转换 （transition） 颠换 （transversion）,基因突变的类型,缺失（delelation）是一个或多个核苷酸的丢失：在基因一级结构中某个位点上，一个核苷酸或一段核苷酸序列丢失造成的基因结构改变。,3. 插入（insertion）,基因突变的类型,倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因内部的DNA序列重组，使一段DNA序列的方向倒转。 配子突变与体细胞突变 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变（dynamic mutation）,碱基置换突变 (substitution mutation),(二) 不同的基因突变引起不同的遗传效应,a. 同义突变 (consense mutation),b. 错义突变 (missense mutation),c. 无义突变 (nonsense mutation),d. 终止密码子突变或延长突变,e. 起始密码子突变(initiation codon mutation),f. 非编码序列点突变 (point mutation in noncoding sequence),同义突变(same sense mutation)：密码子发生改变, 但所编码的氨基酸不变。,例如：CUU CUC CUG 亮氨酸,错义突变（missense mutation）指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。,错义突变结果产生异常蛋白质和酶。但也有不少基因由于错义突变产生部分降低活性和异质组分的酶，不完全抑制了催化反应，这种基因称为漏出基因（leaky gene）。有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不表现出明显的表型效应。,由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变 (nonsense mutation) 。,亮氨酸的密码子UUA，中间的U变为A这样一个碱基变化就会成为（终止密码子）UAA。,酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便到此停止。,当DNA分子中一个终止密码发生突变，成为编码氨基酸的密码子时，多肽链的合成将继续进行下去，肽链延长直到遇到下一个终止密码子时方停止，因而形成了延长的异常肽链，这种突变称为终止密码突变（termination codon mutation）或延长突变（elongtion mutation）。,当基因内部不同位置上的不同碱基发生了两次突变，其中一次抑制了另一次突变的遗传效应，这种突变称为抑制基因突变（suppressor gene mutation）。,如单纯6谷氨酸缬氨酸，则可产生HbS病，往往造成死亡。但Hb Harlem临床表现却较轻，即73的突变抑制了6突变的有害效应。,(2) 缺失或插入突变(deletion or insertion mutation) a. 密码子缺失或插入(codon deletion or codon insertion) b. 移码突变(frame-shift mutation) c. 整基因或大片段缺失 (deletion of a whole gene or a large segment) (3) 融合突变(fusion mutation) 细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对， 产生两种含不同等位基因的染色体。,移码突变(frame-shift mutation)：指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱基（但不是三联体密码子及其倍数），在读码时，由于原来的密码子移位，导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。移码突变造成的肽链延长或缩短，取决于移码终止密码子推后或提前出现。,(4) 基因突变影响 hnRNA 的剪接,基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。,(三) 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病,1. 血红蛋白病 (hemoglobinopathy)： 血红蛋白(hemoglobin, Hb)的结构特点 珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达,血红蛋白结构,血红蛋白是由4条肽链（两个和两个链）组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。,血红蛋白的脱氧（T）和氧合（R）构象在氧的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。,血红蛋白分子一级结构上的轻微差别就可能导致功能上的很大不同，正常成年人血红蛋白中的链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS 的生成。,血红蛋白病镰刀形细胞贫血症,(1) 人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构,(2) 人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构,血红蛋白病类型,异常血红蛋白: 珠蛋白结构(质)变异，导致贫血。,地中海贫血: 珠蛋白合成(量)减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。,(四) 常见单基因病：,疾病名称 发病频率( ) 遗传方式 致病基因 典型症状 血友病A 0.1 X连锁 凝血因子 不规则出血 血友病B 0.03 X连锁 凝血因子 不规则出血 杜氏肌营养不良 0.3 X连锁 肌营养因子 肌萎缩 贝氏肌营养不良 0.05 X连锁 肌营养因子 肌萎缩 脆性X综合征 0.5 X连锁 FMR1 智力障碍 舞蹈病 0.5 常染色体显性 舞蹈病因子 痴呆 神经纤维 0.4 常染色体显性 NF-1,2 癌变 珠蛋白生成障碍性贫血 0.05 常染色体隐性 珠蛋白基因簇 贫血 镰刀细胞贫血 0.1 常染色体隐性 珠蛋白基因 贫血, 局部缺血 苯丙酮酸尿 0.1 常染色体隐性 苯丙氨酸羟基化酶 无苯丙酮酸代谢能力 囊性纤维化 0.4 常染色体隐性 CFTR 进行性肺损伤及其他,基因突变类型 异常Hb 氨基酸变化 临床特征 错义突变 Hb Shuangfeng 27GluLys(GAGAAG) 不稳定Hb病 Hb S 6GluVal(GAGGUG) 镰刀型细胞贫血 Hb Bibba 136LeuPro(CUGCCA 不稳定Hb病 无义突变 Hb Mckees Rocks 145Tyr终止(UAUUAA) 不稳定Hb病 终止密码突变 Hb Constant Spring 142UAACAA- - -地贫 (延长：142Gln- -173UAA) 密码子缺失 Hb Gun Hill 9195缺失 不稳定Hb病 密码子插入 Hb Grady 118与119间插入3个氨基酸 无明显症状 移码突变 Hb Tak 147UAAACU AA- 不稳定Hb病 -158UAA(Thr) 融合突变 Hb Lepore-Boston 87(Gln)-116(His) -地贫 Hb Kenya 81(Leu)-86(Ala) -地贫,囊性纤维化病(cystic fibrosis, CF),囊 性 纤 维 化 病,囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTCR)的基因突变所致，产生缺陷型蛋白，致使使氯离子的转运障碍，黏液在呼吸道黏膜内淤滞，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反复感染，导致患者呼吸衰竭而死亡。,Gene therapy of CF,将重组CFTCR基因cDNA-病毒载体，用涂布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法，转入患者呼吸道上皮细胞中，获得正常CFTCR基因的表达，纠正Cl转运缺陷，减少黏液分泌。,(五)细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病,人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。 AFP 接受异常的细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。 粉尘刺激 肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞 分泌TGF-1 成纤维细胞 促细胞分裂和ECM 蛋白基因表达 ECM 增加 矽肺发生,（六）细胞内因素导致基因表达异常引起疾病,异常的细胞内信号 高血糖 DAG PKC ACE Ang ,病原生物基因的体内表达,异常的DNA甲基化 hCG5转录起始区低甲基化非滋养层细胞hCG 受体结合 cAMP Tumor ,二、基因结构和表达与疾病的研究策略,1通过结构分析确定基因变异 核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、 化学切割错配、酶促切割错配,3通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、 反义技术、基因诱导超表达,2基因表达水平分析 差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析,核糖核酸酶切分析,基本原理: 在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。,核糖核酸酶切分析（RNase cleavage）, Watterson et al., J Clin Microbiol (1998) Mutation scanning Nested PCR of wild type and patient Inner promoter primers SP6 and T7 In vitro transcription of each RNA strand RNA:RNA heteroduplexes RNA proficiency required Cleave with RNase 1 and T1 (not RNase A) Gel detection; could include isotope incorporation,核糖核酸酶切分析（RNase cleavage）,缺点： 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割； 分析DNA的一条链，突变检出率为 30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为 70%； 需要制备特异性的RNA探针,杂合双链分析法 （heteroduplex analgsis, HA）,直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。,杂合双链分析（ heteroduplexes analysis）,Lanes 10 and 11 show the mixture of M and S samples with the control samples where besides the homoduplex line we are able to observe a heteroduplex line (top arrow).,化学切割错配法 （Chemical cleavage of mismatch, CCM）,基本原理： 将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。,化学切割错配法,特点： 突变检出率高； 如使用荧光检测系统，灵敏度较高； 可检测长度达 2Kb的核酸片段； 步骤多、费时、有毒； 碳化二亚胺检测法,酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage ),polymorphisms can be identified by EMC in DNADNA heteroduplexes. T4 Endo nuclease VII samples are PCR amplified, denatured and hybridized to create DNADNA heteroduplexes Enzymes cleave adjacent to the mismatch and products are resolved via gel or capillary electrophoresis. the cleavage enzymes often nick complementary regions of DNA as well. ( increases background noise, lowers specificity, reduces the pooling capacity of the assay),RFLP-Restriction Fragment Length Polyhmorphism,RFLPs,Microsatellite repeats,差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR),在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。,原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。 3端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：,根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。 5端引物：5端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。 用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。,抑制性差减杂交 (SSH) - Diatchenko L, et al. PNAS 1996; 93:6025-6030 Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries,抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH) 原理 SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。,方法 提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别 4 碱基的限制性内切酶切割 实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头 进行2轮差减杂交和抑制性PCR 获得富集的目的基因,抑制性 差减杂交 (SSH) 流程图,检测组 (Tester) 含目的基因cDNA，加接头 驱逐组 (Driver) 不含目的基因cDNA，不加接头 * 接头含PCR 引物 正向SSH: 易感者(Tester) + 不易感者(Driver) 易感者特异表达或高表达基因 反向SSH: 不易感者(Tester) + 易感者(Driver) 不易感者特异表达或高表达基因,抑制性差减杂交(SSH),优点 采用两次差减杂交和PCR，保证了高特异性 (假阳性率可降至6); 在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法 缺点 起始材料需要 g 级量mRNA; SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度,抑制性差减杂交(SSH),Elkeles A,et al. Mol Cell Biol 1999; 19: 2594-2600 The c-fos proto-oncogene is a target for transactivation by the p53 tumor suppressor 采用SSH法证实, 在p53介导的细胞凋亡过程中，c-fos是p53转录刺激的靶基因,从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接依据,抑制性差减杂交(SSH),Kostic C and Shaw PH. Oncogene 2000; 19:3978-3987 Isolation and characterization of sixteen novel p53 response genes 通过SSH比较了p53缺失和含p53的结肠癌细胞株间基因差异表达，发现16个p53依赖的下游靶基因,抑制性差减杂交(SSH),基因表达系列分析 (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE),是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理: 分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。,Serial analysis of gene expression (SAGE) 技术流程,转基因技术,指在生物基因组中带有插入或整合入的外源基因，生物个体能将它一传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。,Transgenic Animal,Animal in which a segment of DNA has been physically inserted into the genome. The genome of all cells of the organism contains the DNA segment. The DNA segment is present in the germ line so it can be transmitted to progeny as a Mendelian trait.,Retroviral Mediated Gene Transfer,MoMuLV Producing Cells,Mouse embryos,Insertion of viral DNA containing transgene into embryos,Transgenic Mouse,X,1-cell pronuclear stage mouse embryo.,PMS + HCG to superovulate, Pregnant Foster Mother,Oviduct Transfer,+,+,2-cell stage embryo,Holding Pipette,Injection Pipette,基因敲除（Knock out）,Step 1. Isolate developing embryo at blastocyst stage. This embryo is from a strain of mice with gray fur.,Step 2. Remove embryonic stem cells from gray-fur blastocyst. Grow stem cells in tissue culture.,Step 3. Transfect stem cells with homologous recombination construct. Select for homologous recombination by growing stem cells in neomycin and GCV.,Step 4. Remove homologously recombined stem cells from petri dish and inject into a new blastocyst that would have only white fur.,Step 5. Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant, white fur mouse.,Step 6. Mother will give birth to a range of mice. Some will be normal white fur mice but others will be chimeric mice. Chimeric mice have many of their cells from the original white fur blastocyst but some of their cells will be derived from recombinant stem cells. Fur cells from recombinant stem cells produce gray patches which are easily detected.,Step 7. Mate the chimeric mice with wild-type white fur mice. If the gonads of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells, all the offspring will have gray fur. Every cell in gray mice are heterozygous for the homologous recombination.,Step 8. Mate heterozygous gray mice (+/ H) and genotpye the gray offspring. Identify homozygous recombinants (H / H) and breed them to produce a strain of mice with both alleles knocked out. The pure breeding mouse strain is a “knockout mouse“.,knockout mouse,核酶技术确定基因在疾病中的作用,1. RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。 2. 优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成“发夹”结构或“锤头”结构。 3. 设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。,What is RNAi ?,RNA干扰（RNA interference，RNAi） 内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。,RNAi 现象的发现,线虫（C. elegans),(Fire, 1998),+,Par-1 Gene Disruption,Expression,Down,Double Strand RNA,线 虫， 果 蝇 微生物， 植 物,dsRNA,Dicer cleavage of dsRNA,siRNA,RNAi 抑制基因表达的机理,Cell Membrane,RNA干扰(RNA interference, RNAi) RNAi 是将一段双链的RNA 序列导入机体或细胞中, 机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制, 甚至表达受到完全抑制,基因诱导超表达技术确定基因在疾病中的作用,将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较加入诱导剂前后的表型变化，从而确定目的基因在疾病发生中的作用。,三、疾病相关基因的功能克隆和定位克隆,1 疾病相关基因 2 功能克隆 3 定位克隆,疾病相关基因与疾病,单基因病 (一个基因位点上的缺陷) 多基因病 (涉及两个以上的基因位点) 染色体病 (染色体结构与数目的改变) 获得性基因病 (遗传易感性或病原微生物),功能克隆(Functional cloning),以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，分离鉴定出相应的基因，叫未知基因的功能克隆。,基因克隆（gene cloning) 功能克隆（ functional cloning） - 根据特异蛋白质分离目的基因的策略 表型克隆（ phenotype cloning ） - 根据特异mRNA 分离目的基因的策略,功能克隆 氨基酸序列 核苷酸序列 PCR 特异蛋白质 目的基因 抗体 基因文库筛选 评价 优点 - 在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略 缺点 - 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难* - 难以分离微量表达基因 - 无法研究无蛋白质产物的基因 - 难以进行多基因控制性状的基因分离,通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因,基因转录后在核糖体上翻译合成蛋白质，形成核糖体-mRNA-蛋白质产物部分氨基酸序列的复合体，运用抗体与蛋白质产物的免疫共沉淀反应，可以分离此复合体，进而分离到mRNA，最终克隆到未知基因。,西红柿女孩 一女孩患苯丙酮尿症，不食“人间烟火”，仅能吃西红柿。智力发育不全、严重的呕吐，皮肤、毛发颜色变浅，虹膜颜色减退、尿、汗有特殊腐臭。目前以低苯丙氨酸饮食治疗。,定位克隆,又称为“逆向遗传学”，始于20世纪80年代后期 利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。 定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。,疾病,遗传标记，染色体定位,基因 序列,mRNA cDNA,蛋白质产物 生物学功能,疾病,基因,功能,定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因在染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选 ，并获得cDNA及全基因。 基本思路是通过连锁分析原理进行基因定位。 若多态标记与待定基因距离较远 ，则它们在向子代传递时会发生自由分离 ，呈“连锁平衡”；反之 ，则不发生自由分离 ，而呈现“共分离”现象 ，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的基因。,将基因定位于染色体 特定区段 2. 候选基因筛选鉴定,定位克隆的主要步骤之一是将目标基因定位于特定染色体上。 主要方法： 家系遗传调查分析法、染色体断裂点分析 （家系选择、分离分析、连锁分析） 体细胞杂交法 核酸杂交技术 突变分析技术,家系遗传分析法,选择一个含有40多个能提供信息的减数分裂事件的三代以上 的家系，要排除家系的异质性； 除了对照基本遗传表型的各种表现型的几率外，还要考虑外显不全；以数学计算机模型模拟分析； 选择一定的遗传标记，进行基因分型，确定疾病基因在染色体上的位置。,基因连锁分析,连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（ RFLP ）为遗传标志进行家系分析 在人类基因组中，平均约 200 bp可发生一对变异 （称为中心突变 ） 中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性 用该限制酶水解 DNA就会产生长度不同的片段，称RFLP。,定位候选克隆,该方法是定位克隆的进一步发展 将疾病相关基因定位于染色体相关区域 该染色体区域得到若干候选基因 进一步分析得到目的cDNA 蛋白质功能研究,疾病,染色体定位,若干候选基因,确定目的基因,蛋白质功能,cDNA筛选 染色体定位只是定位克隆的其中一步。由于DNA筛选、确认的困难 ，是定位克隆策略的“瓶颈”。 目前获得基因序列的方法大致有: (1)对 500kb 的关键部位进行直接测序； (2)比较基因组作图和测序； (3)基因结构特征分析； (4)cDNA捕获，主要有pG岛捕捉层析法、 外显子捕捉法、直接筛选PCR法等方法,cDNA筛选,直接法：用基因组DNA直接从cDNA文库中筛选位于该基因组片段内的cDNA。 选择法：将基因组DNA固定在膜上，与总cDNA或cDNA文库的PCR产物杂交，找到能杂交到膜上的cDNA片段，再用PCR扩增这些cDNA片段。,通过EST拼接,如：已知小鼠某基因在人当中有高度同源序列 用该小鼠cDNA比对人的EST数据库 得到一簇EST后，将相邻的EST通过相互重叠部分进行拼接。 得到人对应的完整cDNA的序列后，两端设计引物在cDNA文库中进行PCR，得到该cDNA的克隆。 至此，与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来。,基因芯片技术的应用,使用传统方法寻找新基因，不仅需要投入大量的资金，而且针对性不强，效率低下，大部分工作繁琐重复。 通过基因芯片分析正常组织和疾病组织基因表达情况的差异，往往能够从那些表达异常的基因中发现新的致病基因。,四、HGP与疾病相关基因的研究,随着人类基因组草图测定的完成，宣告了“ 后基因组时代 ”的到来。功能基因组学成为研究的重心，蛋白质组学的研究受到了空前的关注，也为疾病相关基因的克隆创造了条件。,同一种细胞或组织，处于不同的状态（生理与病理等），发育的不同阶段，受到外界的不同影响时，都可能使细胞中蛋白质的情况产生相应的变化，从而产生不同的蛋白质组。蛋白质组学关注和研究的就是这些变化。,研究蛋白质与疾病相互关系的方法,ELISA 免疫印迹 免疫沉淀 蛋白质亲和层析 毛细管电泳,噬菌体展示技术,丝状噬菌体基因,建 库,筛选,核糖体展示 (ribosome display),核心是利用体外核糖体表达载体构建 sc Fv抗体库 ,并于体外转录为 m RNA, 体外翻译表达 , 随后以固相化的抗原分子亲和筛选出核糖体 -m RNA-sc Fv复合物中的高亲和力 sc Fv。这种技术在实验中不用任何细胞 ,是第一个完全在体外筛选有功能蛋白的方法。,特点,不需转化细菌或真核细胞 避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库 容下降 , 亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。 由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛选的特点 , 大大缩短了实验周期 , 具有省时省力、方便快速的特点。,蛋白质组分离技术 双向凝胶电泳技术,双向凝胶电泳技术(2DE)：又称二维电泳，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。完整的双向凝胶电泳分析，包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDSPAGE、斑点染色、图像捕捉和图谱分析等步骤。,双向凝胶电泳技术的应用,用于分离细胞或组织蛋白质粗提物 构建特定组织或细胞的蛋白质“二维参考图谱”； 分析特定时间与病理、生理状态下蛋白质的表达情况，进行蛋白质组差异比较。 已构建特定组织或细胞的蛋白质2DE图谱数据库 不同生物、不同器官、组织、细胞的专一性2DE数据库，为实现对已知蛋白质的分析鉴定、未知蛋白的发现、总结蛋白质结构、性质与功能的规律以及实现模拟与预测等奠定了基础。,1疾病的蛋白质组研究 （1）肿瘤蛋白质组研究 （2）心血管疾病蛋白质组研究 （3）神经系统疾病研究 2病原微生物的蛋白质组研究 3蛋白质组药物开发,生物信息学主要研究领域, 建立和管理各种生物信息数据库 核酸序列数据库 三维结构数据库 基因组序列信息的提取和分析 序列比对（Alignment）和结构比对 蛋白质结构预测 蛋白质编码基因的计算机辅助识别 非编码区分析和DNA语言研究 分子进化和比较基因组学 、遗传密码的起源 序列重叠群（Contigs）的装配 生物大分子结构模拟及其与疾病、药物设计 DNA芯片和微阵列的发展,建立和管理各种生物信息数据库,各种生物数据库的建立是一切生物信息学工作的基础。 数据库是生物信息学的主要内容，各种数据库几乎覆盖了生命科学的各个领域。如EBI的SRS(Sequence Retrieval System