课件：《猪血清白蛋白的分》PPT课件.ppt

血清白蛋白的 分离、纯化与鉴定,血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总量的60。 它是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。 此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛 。,实验目的,掌握血液样品的正确处理和制备方法 掌握血清白蛋白粗分离的一般方法 掌握离子交换法分离纯化蛋白质 掌握蛋白质纯度检测的方法 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法 学会考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,原理与操作,血清的制备,白蛋白的分离,白蛋白的纯化,蛋白质含量的 测定,白蛋白纯度的检测,白蛋白的相对分子质量的测定,留样：2，3,留样：4,留样：1,一、血清白蛋白的分离,1 采血 2 血清分离 3 盐析法分离血清白蛋白 4 除盐,收集血清： 取2 mL血液，4 ，3,000 rpm 离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 mL至10 mL离心管；留0.1mL（样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳.,盐析：中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。 中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。 分级盐析实现蛋白质的分离纯化。 在血清中加入硫酸铵，当饱和度为50%时，血清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，饱和度达55%，白蛋白析出。,量筒量取9 ml底液（50 %的饱和硫酸铵溶液），用移液管逐滴加入，不断摇晃。4 静置2 h； 4 ，13,000 rpm离心20 min，收集上清，留0.5 ml（样2）至1.5 ml离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；,用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5，用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH4.5）的体积（0.11V）； 逐滴加入饱和硫酸铵（pH4.5），振荡，4 静置2 h； 4 ，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 mL pH7.4的柠檬酸缓冲液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4存在；留0.1 ml（样3）至1.5 ml离心管，用于测定蛋白质含量和电泳； NH4的检测：奈氏试剂,奈氏反应,奈氏试剂是络盐K2HgI4加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐,砖红色的溶液或沉淀,二、血清白蛋白的纯化,离子交换柱层析： 离子交换柱的安装 平衡 加样 洗脱 样品收集,在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间的静电吸引。 蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度或pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。 本实验采用的DEAE纤维素离子交换剂.,层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱的盐浓度和（或）pH的方式洗脱，后一种方式又可以分为两种：一种是跳跃式的分段改变（梯度洗脱），另一种是渐进式的连续改变（连续洗脱）。,DEAE-纤维素离子交换层析： 装柱：将层析柱垂直固定。将DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜； 洗脱液流速调节为 1mL/min； 上样：将透析袋剪开，用移液管转至层析柱内，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内； 洗脱：采用连续梯度洗脱，用0.021.0molL醋酸醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行洗脱，收集； 记录出现峰值的管号(样品4,) 洗脱速度慢，可直接换B液（ 1.0molL醋酸醋酸铵缓冲液）,五、血清白蛋白的相对分子质量测定 -SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。,SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。 SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态；2.复合物都是椭圆棒状。 因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMW为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMW，再换算成蛋白质分子量,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标为lgMW为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMW，再换算成蛋白质分子量,在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-Bx（MW为分子量，X为迁移率，k、B均为常数） 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,计算猪血白蛋白的分子量 ：logMW=K-Bx,胶的制备,样品的处理 向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液，充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴3 min，取出冷至室温。 上样顺序：标准蛋白；样品1；样品2；样品3；柱层析高峰管号的蛋白质样品4,； 加样量：20L.,电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后120V。 电极缓冲液：pH 8.3 Tris Gly 染色：脱色考马斯亮兰R-250，过夜。 脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）脱色1-3h。,四、考马斯亮兰法测定蛋白质含量 考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250 -蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度. 在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定,操作 （mL）,标准蛋白液：50g/ mL； 样1、2、3稀释100倍 样1稀释600倍（10 l6ml）；样2、3稀释200倍（10 l2ml）；各峰稀释5-10倍（10 l6ml）,按上表加好试剂后摇匀，以0管为对照，于595nm处测定光吸收值，以管做出标准曲线；各样品的光吸收值，取平均值，从标准曲线中查出蛋白质的g数。,三、血清白蛋白纯度的检测,- 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳法,A、胶的制备,B 加样：各步骤留样的样液；层析后的蛋白峰。 样品的处理：样品加等量的40%蔗糖溶液、一滴0.1%溴酚蓝。 加样量：20l样品+ 5(. C 电泳：点样端负极，恒压，开始80V，待样品进入分离胶后120V。 电极缓冲液：pH 8.3 Tris Gly D 染色：脱色考马斯亮兰R-250，过夜。 E 脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）脱色1h。,【结果与分析】,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT