细胞工程(拾页版).docVIP

第一章细胞培养技术是指选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于生命科学领域的重要技术。培养细胞的形态：成纤维细胞型、游走细胞型、上皮细胞型、多型性细胞型。大规模培养的方法（生长方式&类型）：（1）贴壁培养贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。a.生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于细胞培养器皿（板、瓶、片、皿）壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。b.贴壁培养的优点：容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。适用于所有类型细胞。c.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资大；占地面积大； 不能有效监测细胞的生长；（2）悬浮培养悬浮培养：是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等；是在微生物发酵的基础上发通起来的。无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。（3）固定化培养固定化培养：是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法等。动物细胞生长特性：（1）细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素（2）细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差（3）需氧少，不耐受强力通风与搅拌（4）群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）（5）培养过程产品分布细胞内外，成本高（6）原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡培养细胞的增值过程(细胞培养的三个阶段、细胞系的生长)：（1）原代培养期也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。(2)传代期初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。(3)衰退期此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。在早期文献中无限细胞系也称已建立细胞系，现已不用。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。（二）组织培养细胞传代的生存期（传代）一般要经过以下三个阶段：1滞留期细胞接种培养后，先经过一个生长缓慢的滞留阶段。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面，有的则来自培养基中的血清。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。2指数生长期这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数生长期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止而进入停滞期。3停滞期细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。细胞系：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。细胞株：通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。原代培养：用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。传代（再培养）：当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。第二章细胞的营养：1.水：细胞内的良好溶剂 细胞内许多生化反应需要水的参与多细胞生物体的绝大多数细胞必须浸润在以水为基础的液体环境中 运送营养物质和新陈代谢中产生的废物 调节生物体内的温度。2.糖：细胞靠糖的氧化获得能量。葡萄糖是机体活动能量的主要来源。3.氨基酸：是组成蛋白质的基本单位。4.维生素：是人类及动物细胞维持生命和生长所需的一种活性物质。许多维生素是酶的辅酶和辅基的组成部分，对细胞的代谢有重大的影响。5.无机离子和微量元素：钠、钾、镁、钙、氮等无机离子是细胞生长所必需的，他们参与细胞的代谢，是细胞组成所需要的。6.血清：血清中含有多种促进细胞生长的因子，是体外培养细胞所需生长因子的重要来源。血清中含有ABCD四种因子。7.促细胞生长因子：促进细胞生长的激素类物质。影响细胞生长的因素：一、 温度一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是3738。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；把细胞置于2535时，细胞仍能生存和生长，但速度减缓。高温对细胞培养不利。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏，核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。因此，体外培养细胞时一定要避免高温。二、渗透压细胞在高渗溶液或低渗溶液中，可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关，但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此，按一定比例控制培养液中离子平衡，维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力，而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影响细胞基本合成系统。在实际应用中，260320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。三、气体环境和pH体外培养细胞需要理想的气体环境，氧和二氧化碳是细胞生存必须的条件之一。氧参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下，可借糖酵解取得能量，但多数细胞低氧时不能生存。CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的pH有关。在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下，细胞容易生长；总的来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断释放CO2，使培养基变酸，pH发生变化。所以，为了维持培养环境恒定的pH，多采用在培养液中加入磷酸盐等缓冲剂的方法。四、无毒和无菌无毒和无菌是体外培养细胞的首要环境条件。细胞在活体内，偶尔有细菌或有害物质入侵，因体内有强大的解毒系统和免疫系统，可将其解毒或清除，而不易受损害。但在离体的环境中，失去了防御系统，一旦有害物质入侵或细菌污染，可导致细胞死亡，前功尽弃。因此，在选用这些器皿、材料时要注意，若这些物品消毒不彻底，带菌或操作过程不小心使细胞污染，也会导致细胞死亡。若出现交叉污染，可使实验室原来的细胞系失去原有特性，应引起足够的重视。五、辐射线和超声波(一)可见光可见光的波长是39007800。可见光的各种有色光能引起细胞退变，延长核分裂的间期，还可显著降低细胞的附壁能力。因此，体外培养细胞应避免日光直接照射，最好在黑暗中进行培养或短期存放。(二)紫外线弱紫外线下耐受能力强的细胞变化不大，但对敏感的细胞有损害。紫外线强时，新分离的细胞显示：不能进行完全的有丝分裂；在有丝分裂时增加了脱水收缩；在有丝分裂时细胞质的起泡减少。Elrlich腹水癌细胞经紫外线照射后，用飞点紫外线显微镜观察发现被照射表面形成水泡，随后细胞膨胀，损害也渐变严重。(三)放射线X射线对细胞有明显损伤。射线可影响细胞核的分裂。射线使核分裂数减少并出现不正常的核分裂，可使细胞死亡。(四)超声波和振动在超声波振动下，细胞很快会破裂，开始是胞质发生紊乱的流动，原生质胶体结核也有明显变化，若停止超声波振动可回复。细胞致死的原因是由于产生空化作用所致。当超声波在2.5W/cm2时，细胞受损，染色体发生畸变，首先发生畸变的是核染色体。六、细胞接种浓度(密度)在体外培养细胞中，细胞接种数对细胞的生长有影响，适宜的接种密度，可以促使细胞增殖，接种密度太低或太高都不利于细胞的生长增殖。如果培养液与细胞的容积比例大于2000:1，生长物质弥散到细胞外的比例将是细胞内达到低于最小限度的浓度，此时细胞不能再增殖，培养液中的pH变碱，抑制细胞生长，细胞变圆不能贴壁，甚至引起细胞死亡等。如果接种密度太高，每个细胞周围培养液的容积降至0.007mm3以下，由于弥散率的降低，细胞内生物质的浓度增加，容易使排除物或其他代谢产物达到饱和，能量来源也很快耗尽，因此也会妨碍细胞的增殖。如何选择适宜的接种浓度要根据细胞的代谢和生长繁殖速度以及工作的需要而确定。一般来说，细胞代谢旺盛、生长速度快的细胞如肿瘤细胞，接种浓度宜偏低；而正常组织细胞生长较慢，代谢不够旺盛，接种浓度可偏高；如果是为了保种或不需急用，接种浓度可偏低些；有时为了便于观察细胞形态结构，接种浓度也可适当降低。七、容器转动速度和悬浮搅动速度当悬浮搅拌培养细胞时，搅拌速度既不能太快，也不能太慢。如太慢，细胞易结团、下沉和贴壁，不利于细胞在悬浮状态下增殖。如果太快，容易起泡沫，细胞易窒息致死，同时，强烈地搅动易使细胞因机械损伤而破裂。所以选择适宜的搅拌速度很重要。各种细胞的适宜搅拌速度不一致，通常与细胞的特性和质量有关，予以注意。第三章细胞培养的必备设施：1.无菌实验室：无菌实验室的设计原则是有防止微生物污染和有害因素影响的措施，要求工作环境清洁、空气清新、干燥、和无尘埃。一般由三部分组成：更衣室：更衣室放在外面，主要供更换衣帽及鞋子等。缓冲间：缓存间位于更衣室与操作间之间，也可同时和几个操作间相通。操作间：放在内间，主要供无菌操作及细胞培养，房间应不受日光直射，大小适宜，高度适宜。2.超净工作台：宜安装在避免日光照射、清洁无尘的房间内；久未使用的工作台在使用前应进行彻底清洁、消毒灭菌；工作台内不应放置与细胞培养无关的物品；要注意过滤器的效果。3.恒温培养箱：特点：恒温、气体流通、提供较为恒定的CO2。4.显微镜：最必须的显微镜是普通显微镜、倒置显微镜。器材的清洗：为何清洗？做到无菌。不同材质处理的方法不同。为何包装？以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。最常用的方法：紫外线消毒、温湿灭菌（高压蒸汽）过滤除菌：是用物理阻留的方法将液体或空气的细菌除去，以达到无菌目的。所用的器具是含有微小孔径的滤菌器。常用于对热不稳定的物质的除菌，主要用于血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品及空气的除菌。高压灭菌：玻璃、橡胶、器械及部分塑料制品，以及盐水、PBS缓冲剂等。过滤除菌：有活性物质的条件培养基，细胞因子和培养基等。紫外线消毒：空气、超净工作台面及塑料器皿，甲基纤维素的粉剂等。平衡盐溶液：又称为生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体，主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。消化液：体内对食物消化起作用的液体，常用胰蛋白酶溶液，主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来。抗生素溶液：为防止细胞培养过程中发生污染。台盼蓝：是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。还常用于细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。天然培养基也称复合培养基，是含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物。天然培养基主要取自动物体液或从动物组织分离提取。其优点是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是成分复杂，来源受限。（小牛血清：取年龄在6个月，体重达226kg的小牛放血致死而得；酵母浸出液：在无血清蛋白存在时可促进细胞增殖，酵母浸出物中有几种结合蛋白的物质对增加细胞的生长率特别有利。）人工合成培养基：是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。合成培养基一般用于实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究。基本培养基：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基。第四章原代细胞培养：概念：将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法（老师：从体内取出组织或细胞的第一次培养）。在别人未做过的或买不到现成的情况下使用。优点：细胞直接来源于机体组织，生物性状尚未发生大的变化；具有二倍体遗传性，大多数细胞表现原来的细胞特性。取材的基本要求：1.注意新鲜和保鲜。2.应严格无菌。3.防止机械损伤。4.去除无用组织和避免干燥。5.培养组织的选择：尽量选用易培养的组织进行培养。原代培养的主要步骤：准备活动物取材剪碎消化（目的：分离单个游离细胞）培养传代冷冻保存。（简单解释）组织块培养：是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶中，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。组织块培养总过程：粗切细切冲洗、自然沉降留少许BSS移入培养瓶中并吸净BSS（翻转干涸法继续培养）或（薄层营养液培养法培养24h后补液）细胞生长。器官培养：是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，仍保持原有器官或组织结构的联系，并能成活。细胞档案：将组织来源、生物学特性、培养基要求、传代换液时间、扩增时间、特殊遗传标志等方方面面记录。细胞纯化：从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。细胞克隆：从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体。第六章干细胞：是一种具有自我复制和分化潜能的细胞，包括成体干细胞和胚胎干细胞。胚胎干细胞：是一种具有向任何一种组织分化潜能的全能干细胞。胚胎干细胞有以下特点：一是具有多能性，二是能自我更新。多能性是指胚胎干细胞可以分化成各种不同的细胞类型并参与到发育过程中，一个基本的标准是胚胎干细胞具有向三个胚层分化的能力。自我更新是指在长期培养中，胚胎干细胞可以维持自己的多能性而不会随着分裂而丧失，这是一个胚胎干细胞系所必须具有的特征。（另一说：胚胎干细胞的特点：(1)胚胎干细胞具有多向分化潜能，可分化为成年人体任何一种组织细胞。 (2)胚胎干细胞具有无限增殖性。 (3)胚胎干细胞的来源受到伦理、道德的限制，取材较为困难。 (4)胚胎干细胞可在不经诱导的情况下自动分化，因此在移植入人体后其分化不好控制，易形成脐胎瘤。）胚胎干细胞的研究意义：1. 胚胎干细胞的分离及体外培养的成功，将给人类带来医学革命。胚胎干细胞经基因修正或基因置换的基因治疗后所产生的子代，可彻底根治遗传缺陷病。2. 胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究发育过程中的极早期事件的良好材料和方法，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。3. 胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发生机制和发展过程，以便找到有效和持久的治疗方法。胚胎干细胞的应用前景：1揭示人及动物的发育机制及影响因素2. 药学研究方面：胚胎干细胞系可分化为多种细胞类型，又是能在培养基中不断自我更新的细胞来源。它发展为胚体后的生物系统，可模拟体内细胞与组织间复杂的相互作用，这在药物研究领域具有广泛的用途。3. 细胞替代治疗和基因治疗的载体：胚胎干细胞最诱人的前景和用途是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。当然，干细胞技术的最理想阶段是希望在体外进行“器官克隆”以供病人移植。如果这一设想能够实现，将是人类医学中一项划时代的成就，它将使器官培养工业化，解决供体器官来源不足的问题；使器官供应专一化，提供病人特异性器官。人体中的任何器官和组织一旦出现问题，可像更换损坏的零件一样随意更换和修理。胚胎干细胞分离培养的基本程序(一)选择抑制细胞分化的培养体系1、饲养层培养体系2、条件培养体系3、培养液中添加分化抑制因子体系（二）早期胚胎的选择（三）胚胎干细胞的分离（四）胚胎干细胞的保持（五）胚胎干细胞的鉴定（六）胚胎干细胞的分化潜力验证成体干细胞：指自我复制和分化产生一种或一种以上子代组织的未成熟细胞。成体干细胞的特点：(1)成体干细胞获取相对容易，受伦理学争议较少;(2)如果源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂;(3)成体干细胞的分化需要诱导，因此成体干细胞致瘤风险较低。(4)尽管成体干细胞具有横向分化的潜能，但其分化潜能比胚胎干细胞低,通常只能向某几种细胞类型分化，分化方向由其来源组织决定。饲养层细胞：在细胞培养中其分化抑制作用的单层贴壁细胞。干细胞研究引发的争论：（哥是支持的，毕竟改卷的是韩老师对不？）胚胎干细胞可用于体外研究人类胚胎发生发育过程，有助于理解分化发育机理、认识生命和疾病现象；通过对其体外分化和定向分化的研究，识别某些靶基因，为人类新基因的发现及其功能的研究提供新的方法；HES细胞最为深远的潜在用途是通过定向分化诱导产生各种特化的细胞和组织，用于修复或替换丧失功能的组织和器官，这为人类疾病的基因治疗开辟广泛的应用前景。倘若这些理想能够一一实现，人类长生的梦想将不再遥远。第十章细胞冷冻：细胞的传代是有限的长期连续传代细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态也会有一定退化或转化，因而细胞失去原有的遗传习性，因此在实际工作中常需冻存一定数量的细胞。冷冻过程：1.细胞悬液制备；2.加保护剂，常用的有DMSO和甘油；3.分装和封口；4.液氮冻存：分级冷冻：将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4摄氏度）约40min；将冻存管放入普通冰箱冷冻室（-10-20度约3060min；将冻存管放入低温冰箱（-30度），放置30min；将冻存管移到超低温冰箱（-70-80度）过夜；最后将冻存管投入液氮保存。四唑盐（MTT）比色法：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。此法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞毒性实验和肿瘤放射敏感性的测定等。植物细胞植物细胞的全能性：每个细胞包含产生一个完整有机体的全部基因，在适当条件下，一个细胞就可以形成一个全新的个体。植物细胞工程：在植物全能性的基础上，以植物细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，使植物细胞的某些特性按照人们的意愿发生改变，达到改良新品种的目的。原生质体培养：指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。植物组织培养：将植物体的某个部位从母体植株上取下，分割成一定大小或分离成细胞，转移到无菌培养液上进行体外生长、发育的一门技术。外植体：指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。 愈伤组织：植物局部创伤后或在组织培养中，当已分化的细胞恢复了细胞分裂能力，而增殖形成的无组织结构、无器官分化的薄壁细胞团。继代培养：指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上。继代培养与动物传代培养的异同：传代培养是原代培养到一定程度，用酶或者其他消化液消化，使细胞打散成单个细胞，然后分开成几分（比如4份）到新的培养基里面继续培养而继代培养是植物细胞培养到一定程度（营养消耗到一定程度），不打散，直接更换新培养基。相同点是都是营养等被消耗，代谢物累积。不同是一个要打散分开培养，而另一个是不打散一整块转换培养基。动物贴壁培养，密度不能太大，所以要打散分开培养；而植物没有接触抑制，所以密度可以比较大，不用分开培养。植物细胞培养基含主要成份：1、无机物：如：Fe、Mn等13种元素；2、有机物： 碳源：如蔗糖、葡萄糖 氮源：氨基酸等 生理活性物质：硫胺素等3、生长调节物质：吲哚乙酸、激动素、肌醇细胞分裂素、赤霉素等动物细胞培养基与植物细胞培养基的区别。成分动物培养基植物培养基无机盐有有碳源糖类糖类、肌醇氮源氨基酸蛋白质水解质和各种氨基酸维生素脂溶性和水溶性的都有B族维生素、生物素、肌醇植物生长调节剂无生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯其他成分动物血清、添加剂（激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子）无组织培养的基本技术1、准备工作（1）培养材料的消毒：刀、剪、镊、纱布、玻璃器皿、培养瓶等。消毒步骤：自来水冲洗蒸馏水冲洗高压灭菌（2）培养液的制备：A、直接称取；B、母液法：根据相律探索出相平衡形成母液法生长磅镉汞液相外延膜新的工艺方法。该方法工艺简单，外延膜组份易于调整和控制。（3）选择合适的外植体：需考虑的因素：A、大小适宜；B、植物不同部位的外植体分化能力、条件及分化类型差别很大；C、幼龄组织比老化组织更容易去分化；D、不同物种相同部位的外植体细胞分化能力大不一样；E、外植体的分化及再分化的最适条件需要摸索。2、诱导去分化阶段：使植物失去原来的分化状态，成为胚性状态 。培养基中添加较高浓度的生长素类激素。3、继代增殖阶段4、生根发芽阶段5、移栽成活阶段应用：脱毒马铃薯、脱毒草莓的大量繁殖生长等。单细胞制备方法：（1）机械法：磨碎、切割指物体；（2）酶解法：用专一性水解酶分解细胞壁；（3）愈伤组织诱导法：通过植物组培获得愈伤组织，通过高频振荡从悬浮愈伤组织中振荡下单个细胞。植物细胞大规模培养基本步骤：A、建立细胞株：选择次生代谢物含量高的