赵晓妮细胞培养论文.doc

动物胚胎干细胞的培养技术摘要：1885年，W Rou尝试使组织离体培养，被认为是组织细胞培养技术的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术（Cell culture technology）的诞生。此后，随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进，动物细胞培养（Animal cell culture）的研究和应用逐步增多和深入，发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。利用细胞培养开展体外试验，成为了阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段；利用细胞培养技术结合细胞融合（Cell fusion）、细胞杂交（Cell hybridization）以及转基因（Trans-gene）技术进行基因重组、组织构建是遗传和组织工程的重要工具；利用细胞培养生产具有医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等，已成为医药生物技术产业的重要部分。1干细胞最早出现于19世纪的文献中。1896年，Wilson在一篇论述细胞生物学的文献中首次使用干细胞这一概念，专门用于描述寄生虫（线虫、蠕虫）生殖系的祖细胞。1897年，Boveri等在进行丝虫研究时发现，在经过连续的卵裂之后，只有一个细胞保留了全部的染色体，这一细胞包含有成体生殖细胞的全部成分。但到目前为止，干细胞仍然是一个广义的概念，但现代干细胞的概念与早期干细胞相比，已经赋予了新的内涵，认为干细胞的最基本特征是具有自我更新能力和分化为成熟细胞的潜能。1962年Edwards首先观察到兔胚泡ES细胞的分化现象。之后，科学工作者对ES细胞进行了深入的研究，取得了诸多突破性的进展。2003年，韩国和美国科学家联手，利用体细胞克隆技术获得人类克隆胚胎干细胞，这一技术的成功表明可以用任何人的自体细胞培育ES细胞，从而使ES细胞向临床应用迈进了一大步。2004年，日本科学家在体外将小鼠的ES细胞诱导分化为精子和卵子细胞，结果进一步证实ES细胞具有向生殖细胞分化的潜能。最近还有科学家利用孤雌繁殖法（卵细胞体外激活培养）培养出早期胚胎，预示人类的自然生殖面临新的课题。3关键词：胚胎干细胞；来源；特点；培养；保存；复苏；前沿；进展1、胚胎干细胞（ES细胞）的生物学特性 3 1.1 ES细胞的来源 ES细胞是来源于特定解剖部位的细胞，包括：胚胎瘤干细胞、由着床前胚泡的内细胞团分离建系而来的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞（由早期胚胎原始生殖嵴细胞分离建系而来）。1.2 ES细胞的基本特点4 具有经培养不定期地分化并产生特化细胞的能力，具有以下特点：有多向分化潜能和受精卵的某些特性，可以分化为胎儿和成体内各种类型的组织细胞；可在体外培养的条件下建立稳定的细胞系，可长期增殖培养、冻存并保持高度未分化状态和发育潜能性；将ES细胞与8-16阶段的胚胎共培养后，植入假孕母体子宫，可发育成嵌合动物，其遗传特性可进入胚系，遗传给下一代；对组织损伤产生反应，可迁徙、增殖分化并参与修复过程。体外ES细胞具有培养细胞的特征，最大特点是可对它进行遗传改造、核转移和冻存等而不失去潜能性。1.3 ES细胞的形态学特点 ES细胞的形态结构与早期胚胎细胞具有相似性，细胞相对较小，细胞核明显，核质比较高，染色质比较分散，有一个或多个核仁，胞质内除游离核糖体外，其他细胞器很少；细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起，无明显的界限，形似鸟巢。人和灵长类动物的ES细胞形成的细胞集落相对扁平、松散，容易被胰蛋白酶消化成单细胞。而小鼠的ES细胞和人的EG细胞形成的集落一般呈紧密的球形，不易被常规的消化方法消化成单个细胞。 1.4 ES细胞的分子生物学标志 碱性磷酸酶、胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA）、端粒酶、Oct-4/Oct-3、干细胞因子和生殖细胞核因子等。2、干细胞实验条件与设备5 干细胞制备培养技术是一种无菌操作技术，要求实验室环境和条件必须保证无微生物污染，不受其他有害因素的影响，并且是符合操作全过程质量控制可追溯性的要求，才能成为临床生物治疗应用技术平台。细胞实验室设立必须符合国家药品生产质量管理规范和GMP要求，应当遵循科学、安全、规范、有效、经济、符合伦理的原则。细胞实验室还必须配备符合现代工艺要求和技术标准的硬件设备。 干细胞实验硬件设备主要有细胞采集仪，细胞分离仪，生物安全柜和净化工作台，低温细胞离心仪，二氧化碳细胞培养箱，细胞质量和活力分析仪，流式细胞仪，倒置显微镜和普通光学显微镜，深低温生物冰箱和普通冰箱，程序降温仪和液氮罐，管道热合仪及制冰机等。3、ES细胞的制备（以小鼠为例）53.1内细胞团的分离与培养 内细胞团的分离方法有两种：显微分离法和免疫外科法。显微分离法是在显微镜直视下机械地进行分离出内细胞团。免疫外科法的原理是：大分子如免疫球蛋白不能通过囊胚滋养外胚层进入囊胚腔，因此利用，免疫介导的细胞毒作用，可选择地破坏滋养外胚层细胞，二囊胚腔内的细胞-细胞团则不受影响。主要介绍免疫方法分离内细胞团。材料与试剂：兔抗鼠血清、豚鼠血清、0.5%链霉蛋白酶、ES细胞培养液、高糖DMED、FCS、1%非必需氨基酸、129Sv孕鼠。操作方法：分离的过程均在石蜡油覆盖的30ul液滴中进行；孵育条件为37、5%CO2；抗体和豚鼠血清均用DMEM培养液稀释。 将见栓3.5d的129Sv孕鼠脱颈处死，剖开腹部，取下子宫角，用37预热的含血清培养液冲出胚胎。0.5%链霉蛋白酶消化约5分钟以去除透明带。然后将胚胎移入含10%FCS的DMEM培养液中培养3小时。用免疫溶解法去除外滋养细胞，过程如下：将胚胎移入1:10稀释的抗鼠血清液滴中孵育30分钟；DMEM液滴洗3-5次，每次5分钟；再在1:10稀释的豚鼠血清液滴中孵育15-30分钟；DMEM液滴清洗；然后用尖端直径为30-40um的细吸管轻轻吹打，分出细胞团，接种到饲养细胞上，在37、5%CO2、95%湿度条件下培养，每天更换培养液。3.2 ES样细胞扩增 内细胞团经过培养后会出现典型的干细胞的集落，将典型的集落用机械法取下，0.05%胰酶消化，打散成单细胞，接种至新饲养细胞上，每天更换培养液，从而得到多个干细胞集落。建立细胞系，传代、冻存。 4、干细胞的保存与复苏 5 4.1 冷冻保存设备 Cryologic 程序降温仪、液氮罐、冷冻保存液（渗透性冷冻保护液、非渗透性冷冻保护液）。4.2 冷冻保存方法 在医学和研究领域多采用细胞外冷冻法，即使在温度相当低的情况下细胞也不会致命。冷冻保存细胞的技术已广泛用于临床，是现代医学中的关键步骤，10%DMSO-196液氮冷冻保存细胞是最经典的方法。传统的慢速冷存法对于可消化为单细胞的小鼠胚胎干细胞系保存是有效的，但对人类胚胎干细胞效果较差。按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，干细胞冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。4.3 干细胞复苏方法 干细胞复苏一般采用快速融化法，以避免慢速融化水分渗入细胞内形成胞内结晶损伤细胞。 注意：自液氮或干冰中取出冷冻管后，首先要检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉或注意冷冻袋有否破裂并采取相应应急措施。每批次冷冻和复苏的干细胞存活率可能会不相同，为避免这个问题，每次干细胞冻存最好分两批以上进行。临床应用或再次培养细胞时应采用细胞活力仪检测细胞存活率。5、干细胞研究前沿与展望5.1 ES细胞研究与应用 干细胞研究是21世纪生命科学领域的一大热门课题。回到令人瞩目的1998年，几乎同时，威斯康星大学的Thomson等和霍普金斯大学的Gearhart等分别报告说，他们利用不同的方法成功地使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖，由此获得了具有无限增殖和分化潜力的人胚胎干细胞。5.1.1胚胎干细胞的分离建系与体外培养8 有关人胚胎干细胞的建系方法有多种，研究最多的是从胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离胚胎干细胞。另一种建系方法则是从终止妊娠的胎儿组织中分离出胚胎干细胞。5.1.2 诱导分化与发育6 胚胎干细胞是最早期的未分化细胞。当处于合适的培养条件下，胚胎干细胞可以分化形成多种细胞类型。正是由于具有这种在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的潜能，是胚胎干细胞成为一种研究哺乳动物细胞分化、组织形成过程的基本体系，也成为临床移植治疗的新的细胞来源。然而，目前科学家对胚胎干细胞定向诱导分化的机制尚不完全清楚，即还不明白胚胎干细胞接受谁的“命令”，此时分化为造血干细胞，二彼时又分化为神经干细胞或别的什么干细胞。这是干细胞工程进一步研究与应用面临的最大困扰，也限制了胚胎干细胞的临床应用。因此，干细胞研究的主要问题之一就是要弄清胚胎干细胞发育分化为的调控机制，从而在体外培养扩增胚胎干细胞并进行定向诱导分化。近年来，科学家们利用胚胎干细胞建立了不同的体外分化模型，并建立各种基因改变的胚胎干细胞系，以求发现某些基因或因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的调控作用。胚胎干细胞体外分化体系已被成功地用于确定一些细胞活性因子，为在细胞水平上分析基因功能提供了强有力的模型系统。5.1.3 远大的潜力与挑战世界范围内的干细胞研究热潮，可以说是由1998年人胚胎干细胞的成功建立而带动的。胚胎干细胞最伟大的用途首先是作为科学研究的工具。当然，此项进展也使科学家们看到了干细胞生物工程的曙光。胚胎干细胞在临床医疗等领域也显示了诱人的应用前景。有诸多理由可说明胚胎干细胞对科学和人类健康发展的重要性。最基本的是人胚胎细胞系的建立及人胚胎干细胞研究可以帮助我们理解人类发育过程中的复杂事件，使人深刻认识数十年来困扰着胚胎学家的一些基本问题，促进对人胚胎发育细节的基础研究。胚胎干细胞系可分化为多种细胞类型，又是能在培养基中不断自我更新的细胞来源，它发展为胚体后的生物系统，可模拟体内细胞与组织间复杂的相互作用，这在药物研究领域具有广泛的用途。胚胎干细胞有望在短期内就能体现的优势在于药物筛选中。目前，在候选药物对各种细胞的药理作用和毒性试验中，胚胎干细胞提供了新药的药理、药效、毒理及药代等研究的细胞水平的研究手段，大大减少了药物检测所需动物的数量，降低了成本。另外，由于胚胎干细胞类似于早期胚胎的细胞，它们有可能用来揭示哪些药物会干扰胎儿发育和引起出生缺陷。胚胎干细胞最诱人的前景和用途是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。任何涉及丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经退变性疾病。5.1.4胚胎干细胞研究面临的难题及伦理学争议7 胚胎干细胞研究仍面临许多技术难题，包括：如何维持体外扩增时不分化？分化细胞的增殖是一个瓶颈问题，如何获得组织工程所需要的种子细胞的数量，很值得研究。而如何得到纯化的分化细胞也有很多工作要做。如何定向诱导干细胞的分化？由胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官，并真正用于器官克隆与移植仍需有技术上得突破。 除以上所面临的难题外，有胚胎干细胞研究所引发的涉及伦理、社会、法律、医学、神学和道德的争议和大辩论也不能不引起重视。胚胎干细胞最终能否得以应用在很大程度上将取决于伦理学与法律问题的解决与否。这些问题有一下几个方面：胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德？将人胚胎干细胞嵌入家畜胚胎中创立嵌合体来获得移植用人体器官是否道德？目前克隆技术尚不完善，没有保障且不安全。任何分化细胞都有形成肿瘤或无控制地生长的特性。胚胎干细胞的安全性如何？5.2干细胞与组织工程9 完美地修复或替代因疾病、战伤、意外事故或遗传因素造成的组织、肢体或器官的伤残一直是人类的“梦想”。而最新的研究结果表明，利用组织工程和干细胞等现代生物医学技术，有可能使这一“梦想”成为现实。 目前组织工程、干细胞研究已经成为21世纪生命科学研究的焦点。组织工程研究涉及种子细胞、支架材料以及组织构建等众多研究领域，干细胞研究则有望解决组织工程研究中的种子细胞来源问题。前者属于生物高技术领域中的一门新兴学科，而后者属于基础医学研究范畴，两者之间紧密联系，但又各有侧重。5.3干细胞与基因治疗10 自从基因治疗进入临床试验后，有关的基础研究已取得很大进展，为了使目的基因能在患者体内长期或永久地表达，并且表达具有靶向性，必须选择一种适合的靶细胞。干细胞因为具有自我更新或自我复制的能力而成为基因治疗理想的靶细胞。 总结：无论是从科学研究还是临床应用角度都有必要尽快加强国产化胚胎干细胞的建系与定向诱导分化研究。重要的研究领域可归纳为几点：建立及完善维持胚胎干细胞的体外增殖与定向诱导分化的体系；研究转基因或转核胚胎干细胞的增殖与分化及其调控机制；诱导分化细胞性能的分析与鉴定；探索克服移植排斥等的技术与方法。设想在不久的将来，干细胞治疗疾病的新技术将被应用到临床，造福于人类。参考文献：1裴雪涛，等，干细胞生物学，北京；科学出版社，2003.7。2杨晓凤、张素芬、郭子宽，干细胞应用新技术，北京；军事医学科学出版社，2010.7。3王延华、羊惠君，干细胞理论与技术，北京；科学出版社，2005.3。4王佃亮，干细胞组织工程技术，北京；科学出版社，