分析化学实验报告1.双缩脲法-2013-0910-ST.doc

实验一 蛋白质的含量测定-双缩脲法一 实验目的：掌握双缩脲法测定蛋白浓度的原理及方法。二实验原理1. 双缩脲反应:在碱性溶液中，双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)与CuSO4作用形成紫红色的络合物，在540nm处有最大吸收，这一反应称为“双缩脲反应”。凡具有两个或两个以上的肽键(-CO-NH-)的化合物都呈双缩脲反应。蛋白质分子中因含有很多的肽键，故所有蛋白质都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，生成的颜色深浅与蛋白质含量成正比，因此可用作蛋白质定量测定。由于参与反应的是蛋白质的肽链结构，与组成蛋白质分子肽链氨基酸残基的侧链功能关系较少。因此，不同蛋白质的双缩脲反应基本相似。2. 分类: 常量法：测定蛋白质浓度范围：110mg/ml,选用540nm比色测定。微量法：选在310330nm检测，灵敏度比540nm检测高10倍。优点: 利用双缩脲反应生成有色物质用作蛋白质的比色测定受蛋白质种类影响较小, 是优点之一。试剂和操作的简单、迅速也是其优点。缺点: 灵敏度较差，仅适用于蛋白质浓度在0 .5mg/ml以上的样品测定 。Tris缓冲液、类脂、色素、一些氨基酸等会干扰此测定。3. 本实验原理:本实验选用面粉作为测试样品，测定面粉中的蛋白质含量。三试剂和器材1测试样品：面粉。2试剂： 标准蛋白质溶液：10mg/mL牛血淸白蛋白（BSA）溶液。 常量法的双缩脲试剂。 0.05mol/L NaOH溶液。3器材：分光光度计，电子分析天平，移液管(10 mL2)，离心机。四实验操作1.标准曲线的绘制：取6 支试管，按下表操作：试管编号01234510mg/mL标准蛋白溶液-0.20.40.60.81.0蛋白质含量（mg）-2.04.06.08.010.0蒸馏水1.00.80.60.40.2-双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0摇匀各管，室温静置30分钟A5400.000 0.121 0.245 0.362 0.481 0.570用Excel 绘制标准曲线及计算公式，如图：2.样品测定准确称取干面粉0.1g,置干燥三角瓶内，另取一个三角瓶作空白。按下表操作: 加入物（ml）加入量空白面粉干面粉_0.10.05mol/L NaOH溶液(充分混匀)2.52.5双缩脲试剂10.010.0样品手摇振荡20 30 分钟，各取8ml置离心管中，3500rp离心，10min，留取上清比色（4ml）。A54000.xxx五结果计算：按下列公式计算出面粉的蛋白含量（mg）:y = 0.0578x + 0.0074 求解X（mg）六注意事项：(1).须于显色后30min内完成比色测定。七思考题：1.干扰双缩脲法测定的因素有哪些？S53/54 紫外可见分光光度计独立使用说明 S53分光光度计使用说明1.开机自检校正（开始时8灯亮,到7灯熄,只有透射比灯亮时，数据变T值，可测）；当前波长波长参数2.设定波长（按下 键到 灯亮，按 或 至要波长参数求波长，再按下 键确认。透射比模式 3 按下 键到 灯亮；4置入空白及样品;5调100%T（关盖，按“100%”键，即能自动调整100%T，一次未到位可加按一次，）；吸光度模式6 按下 键到 灯亮；7调零（关盖，按“100%”键作自动调节吸光度0，一次