动物病毒学)第12章负链RNA病毒.ppt

第十二章 负链RNA病毒,正粘病毒科（Orthomyxviridae） 副粘病毒科（Paramyxoviridae） 弹状病毒科（Rhabdoviridae） 丝状病毒科（Filoviridae） 布尼病毒科（Bunyaviridae） 嵌砂病毒科（Arenaviridae） 波纳病毒科（Bornaviridae）,12.1 正粘病毒科(Orthomyxoviridae),甲型流感病毒属(Influenzavirus A) 乙型流感病毒属(Influenzavirus B) 丙型流感病毒属(Influenzavirus C) 托高土病毒属（Thogotovirus）,1. 病毒形态：圆形或多形（丝状),有囊膜，病毒粒子80120nm。,（一）正粘病毒科的共同特性,2. 核酸： -ssRNA,单股,线状,68节段,全长13.6kb,甲型、乙型流感病毒8节段 丙型流感病毒7节段 托高土病毒6节段,无NA,3. 病毒的基本结构,血凝素(HA） 神经氨酸(NA） 基质蛋白(M1,M2型特异性； M2为离子通道蛋白) 核蛋白(NP，型特异性） RNA聚合酶 ( PB1、PB2、PA） 非结构蛋白(NS1、NS2 or NEP）,编码8种结构蛋白和2种非结构蛋白,囊膜：血凝素(Hemagglutinin, HA) 神经氨酸酶(Neuraminidase, NA),Hemgglutinin - 16 types: H1-H16 Neuraminidase 9 types: N1-N9,血凝素(Hemagglutinin,HA),使其具有血细胞凝集活性 是病毒的吸附蛋白 病毒以膜融合方式进入细胞需要HA的水解 诱生中和抗体和细胞免疫反应，决定病毒的亚型,HA基因裂解位点与病毒组织嗜性,Horimoto and Kawaoka 2005,HA基因中除裂解位点外，97，108，126，138，217位的氨基酸与毒力的关系也非常密切,神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）,识别细胞受体，水解其末端N-乙酰基神经氨酸，促进病毒进入靶细胞 病毒在细胞表面成熟时，NA移去出芽点上的神经氨酸，利于病毒粒子成熟和释放。,4. 病毒不断发生改变,抗原漂移 （antigenic drift） -Genetic mutations 抗原转换 (antigenic shift） -Reassortment +/- genetic mutations,流感难以控制!,抗原漂移（Genetic mutations）导致免疫失败,流感疫苗（2株A型流感病毒和1株B型流感病毒） 免疫后，机体产生针对3种毒株的抗体 在流感流行季节，若有流感病毒感染机体，体内的抗体与HA抗原结合，阻止病毒吸附到细胞上 相对DNA病毒而言，流感病毒的基因更易于发生突变 HA基因发生突变，导致编码的HA蛋白发生结构改变 体内抗体不能与HA蛋白结合，无法达到预防病毒感染目的,抗原转换（Reassortment ）导致病毒跨种间传播,A-1:鸭/其它水禽流感病毒感染鸡或猪 A-2:人A型流感病毒感染上述鸡或猪 A-3:当上述两种病毒感染同一个细胞时，发生基因重组产生新的毒株 A-4:新的毒株可以通过中间宿主感染人,水禽的AIV是其它物种流感病毒的来源,是AIV的储存器 猪是人流感病毒与AIV发生重组的“活试管、混合器”,c,5. 病毒的复制和抗病毒药物使用,流感病毒无论感染猪、禽类或人后均存在相似复制模式,(扎那米韦和奥司他韦/达菲),（二）主要流感病毒,1.禽流感病毒（Avian influenza viruses，AIV）,属于正黏病毒科、A型流感病毒属。 是禽类流感的病原体。,20032010.4.9，全球493人感染H5N1禽流感病毒，292人死亡（Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO ）,2.猪流感病毒(Swine influenza viruses，SIV),能引起猪的高度传染性、急性呼吸道疾病 猪流感病毒大多是AH1N1型，但其他亚型也会在猪中传播，如H1N2、H3N1、H3N2。 禽流感病毒和人流感病毒也会感染猪 猪会同时感染不止一种类型的流感病毒，使得来自不同类型病毒的基因融合，产生 “重组”流感病毒,猪流感病毒又可以感染人 人感染猪流感病毒的可能途径和症状,3. 人流感病毒(human influenza viruses),2009 Novel H1N1,Pandemics of influenza Recorded human pandemic influenza(early sub-types inferred),1889 Russian influenza H2N2,1957 Asian influenza H2N2,1968 Hong Kong influenza H3N2,1900 Old Hong Kong influenza H3N8,1918 Spanish influenza H1N1,2009 Pandemic influenza H1N1,Reproduced and adapted (2009) with permission of Dr Masato Tashiro, Director, Center for Influenza Virus Research, National Institute of Infectious Diseases (NIID), Japan.,Animated slide: Press space bar,1918-1919，H1N1: Spainish flu, 50 M Death 1957-1958，H2N2: Asian flu, 2 M Death 1968-1969，H3N2: Hong Kong flu,1 M death 1977-1978，H1N1: Russian flu，Not known 1997-Now，H5N1: AIV 493 infection，292 death,以前的几次大流感导致的死亡人数,2009年4月首例人感染新型H1N1流感病毒的报道 -是一种之前从未在人和猪身上出现过的 新型流感病毒 -发病人群多为青壮年，而不是季节性流感的易感人群-老人和儿童 病毒传播非常快,造成全球大流行,Genetic origins of the pandemic (H1N1) 2009 virus: viral reassortment,Classical swine, N. American lineage Avian, N. American lineage Human seasonal H3N2 Eurasian swine lineage,Eurasian swine H1N1,N. American H1N1 (swine/avian/human),Pandemic (H1N1) 2009, combining swine, avian and human viral components,2009.4-2010.4，甲型H1N1波及全球214个国家或地区，至少导致17798人死亡，感染人数几乎无法统计。中国内地感染人数至少12.3万，死亡714人。The pandemic virus is currently susceptible to both of these drugs (known as neuraminidase inhibitors), but resistant to a second class of antivirals (the M2 inhibitors).,(三) 流感病毒的防治,疫苗(Vaccines) (2) 药物 (Drugs) (3) 干扰素（Interferon /）,12.2 副粘病毒科（Paramyxoviridae）,一、科的特点 病毒粒子具有多形性（球形和丝状两种形式），直径150-300nm。有囊膜与纤突，衣壳呈螺旋对称。基因组为单股正链的线状RNA，不分节段，长约15-16kb。病毒宿主范围窄。,Paramyxoviridae 副粘病毒 72000X,二、分类,副黏病毒亚科,肺病毒亚科,呼吸道病毒属：牛副流感病毒3型、仙台病毒 腮腺炎病毒属：犬副流感病毒2型、猪腮腺炎病毒 禽腮腺炎病毒属：新城疫病毒 麻疹病毒属：牛瘟病毒、犬瘟热病毒、麻疹病毒 亨尼病毒属：亨德拉病毒、尼帕病毒,肺病毒属：牛呼吸道合胞病毒、人呼吸道合胞病毒 伴肺病毒属：火鸡鼻气管炎病毒,三、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV),新城疫：亚洲鸡瘟、伪鸡瘟 禽流感：欧洲鸡瘟、真性鸡瘟,1926年首次爆发于印度尼西亚的爪哇和英国的新城，1927证实了该病由病毒引起，命名为新城疫 目前，广泛存在亚洲、非洲和美洲的国家 1928年我国已有本病的记载，1935年在我国部分地区流行，1946年首次分离到病毒,新城疫病毒粒子,新城疫病毒（NDV）属于RNA病毒中的副粘病毒科、腮腺炎病毒属的禽副粘病毒，为单股负链病毒。 有囊膜，呈多形型，一般呈近似球形。,直径100-500nm 纤突8-12nm,1、病毒粒子,NP：核衣壳蛋白 P：磷蛋白 M：基质蛋白,F：融合蛋白，小的表面纤突 HN：血凝素-神经氨酸酶 L：大分子蛋白,基因组约15kb长，共包括个基因，依次为：3-NP-P-M-F-HN-L-5,2、NDV基因组结构组成,3、NDV的理化特性,对多种理化因素的抵抗力相当强，能在环境中存活较长时间：ND爆发后2-8周，仍能从鸡舍、蛋壳、羽毛中分离到病毒，但不同毒株间存在差异。 物理或化学因素的处理，如热、射线、各种化学药物均能破坏病毒的感染性,血凝活性： NDV能凝素两栖类、爬行类和禽类的红细胞（所有毒株都能凝集人、小鼠和豚鼠的红细胞，但凝集牛、山羊、绵羊、猪和马红细胞的能力随毒株而异）。 NDV依靠其血凝素-神经氨酸酶(HN) 结合于红细胞表面的含唾液酸的受体，凝集成较大颗粒，这一特性能被特异性抗血清抑制，是鉴定病毒的有效方法,4、NDV的生物学活性,神经氨酸酶活性： NDV的HN蛋白具有神经氨酸酶功能，能水解唾液酸的糖苷键，使受体从红细胞表面脱离，从而使已经被病毒凝集的红细胞发生解凝集。 细胞融合： NDV复制时，病毒首先吸附于细胞受体，随后病毒囊膜与细胞膜发生融合。NDV感染还可导致2个或多个细胞之间的细胞膜融合，形成合胞体,5、NDV的血清分型,所有的NDV属于同一种血清型，但不同毒株的毒力差异很大。 单抗可以检测出病毒亚群间的差异.,NDV不同毒株的毒力有着较大的差异，这主要取决于其HN及F的裂解及活化。 根据毒力的差异可将NDV分成3个类型：,强毒型（velogenic）（嗜内脏型） 中毒型（mesogenic） 弱毒型（lentogenic）,6、NDV的毒力,衡量毒株毒力的指数,经典方法： 1日龄鸡的脑内接种致病指数（ Intracerebral Pathogenicity Index， ICPI） 6周龄鸡静脉致病指数（Intravenous Pathogenicity Index ，IVPI） 鸡胚平均致死时间（ Mean Death Time ，MDT）,衡量毒株毒力的新方法,分子基础： NDV的F蛋白先是以无活性的前体F0的形式存在,当它被宿主细胞蛋白酶裂解成F1、F2两个亚单位时,病毒才具有感染活性。 裂解后的活性蛋白一旦到达质膜表面即可介导感染细胞与邻近的细胞融合,并导致病毒新的感染。,F蛋白的裂解位点,强毒株的F0在接触大多数宿主细胞时都会被胞内蛋白酶裂解为F1 、F2 两条多肽。F1 多肽区直接参与细胞融合活动,具有较强的毒力 弱毒株F0 只能在特定的细胞内被裂解,从而表现出不同毒株致病性的差异。 F蛋白裂解位点位于116 位的氨基酸处,其氨基酸顺序及裂解能力是决定毒力的关键因素。,F蛋白的裂解位点,强毒F1的N端为苯丙氨酸（F),弱毒为亮氨酸（L) 强毒F2的C端存在由谷氨酰胺（Q)隔开的两对碱性氨基酸；而弱毒的两对碱性氨基酸部分被甘氨酸替换 基于上述原理，可以建立区分NDV强弱毒的RT-PCR方法，这也是目前实验室鉴别诊断的首选方法,OIE对ND爆发的定义,两个标准： 1、脑内接种致病指数（ICPI)0.7 2、F1蛋白的N端（117位aa)为苯丙氨酸F，F2蛋白C端有多个碱性aa（113-116位aa至少有3个精氨酸或赖氨酸）,病毒首先在呼吸道及肠道粘膜上皮复制，借助血流扩散到脾及骨髓，产生二次病毒血症，从而感染肺、肠及中枢神经系统。 病毒通过气雾、污染的食物及饮水传播。弱毒株经卵传播是重要途径。耐过鸡可通过分泌物及排泄物排毒至少4周。 抗体产生迅速。HI抗体在感染后4-6d即可检出，可持续至少2年。,7、致病机理,8、临床症状与病理变化,嗜内脏速发型（ Viscerotropic Velogenic Newcastle Disease ， VVND ）各日龄的鸡均易感，急性、致死性感染，常见消化道出血 嗜神经速发型(Neurotropic Velogenic Newcastle Disease ，NVND）各日龄鸡均易感，急性、致死性感染，表现呼吸道和神经症状,中发型一般仅引起幼禽死亡，可作为再次免疫的活疫苗。 缓发型仅出现轻微或隐性的呼吸道感染，一般用作活疫苗。 缓发无症状肠型不引起明显的疾病，某些商品活疫苗属于此类。,嗜内脏速发型（VVND） 超强强毒株感染突然发病、死亡率高而不表现任何临床症状。 开始精神沉郁、呼吸加快、无力、衰竭死亡。 感染早期有绿色下痢，死前有明显的神经症状，肌肉震颤、斜颈、腿和翅膀麻痹和角弓反张。 易感鸡的死亡率可到100%。,鸡新城疫精神沉郁,鸡新城疫呼吸加快,腺胃乳头出血,嗜内脏速发型（VVND）,腺胃交界处呈带状出血,腺胃前部-食道移行部,腺胃后部-肌胃移行部,盲肠扁桃体出血,十二指肠出血性溃疡,小肠出血,肠道浆膜出血,泄殖腔粘膜出血,卵泡出血斑,嗜神经速发型（NVND） 主要报道于美国； 突然发生严重的呼吸道症状，1-2天后出现神经症状； 产蛋急剧下降，不出现下痢； 发病率可到100%；成年鸡死亡50%，小鸡达90%。,鸡新城疫神经症状,嗜神经速发型（NVND）,气管、喉头粘膜充血和出血,中发型 引起呼吸道症状 成年鸡产蛋下降，可持续几周 也可能出现神经症状 死亡率较低,缓发型 成年鸡不发病 易感幼鸡可出现呼吸道症状 并发和继发其它微生物可引起死亡,中发型产畸形蛋,9、诊断,毒株、宿主和其它因素各异，疾病的差异就会很大，临床症状和病理变化只能作为ND的一个指征，不能作为确诊的依据。,病原检测 抗体检测 分子诊断 鉴别诊断,病毒分离鉴定,病毒抗原检测：免疫荧光检测气管切片和组织触片。 病毒的分离鉴定：是NDV确诊的唯一公认的方法。,样品采集,培养系统,分离方法,病毒鉴定,抗体检测,证实免疫是否成功以及免疫反应的强弱。 抗体不能反应毒株的情况，诊断意义不大。 血凝抑制（HI）和酶联免疫吸附试验（ELISA），相关性高，最常用。 中和试验、琼脂扩散等。,分子诊断,RT-PCR(包括荧光定量RT-PCR) 产物用于病毒的特征和来源分析 限制性内切酶分析 探针杂交 裂解位点的核酸序列分析,10、疫苗,*气雾免疫时可能会引起严重的反应,活疫苗 感染胚尿囊液冻干而成。 初免应该用低毒力疫苗株，需要多次接种。 首免饮水免疫，二免用气雾免疫。,灭活苗 感染胚尿囊液用福尔马林杀死病毒，与佐剂混合。 可以选用强毒株作为疫苗株。 可以制成二联或多联苗。 肌注。,12.3 弹状病毒科（Rhabdoviridae),Rhabdoviridae 弹状病毒 216000X,病毒粒子呈子弹状，大小约18075nm，有囊膜。基因组为单一分子的负链单股RNA，长约13-16kb。在感染细胞胞浆中形成特异性的包涵体，称为内基氏小体（Negri bodies）。病毒宿主范围广。,一、科的特征,狂犬病病毒 牛暂时热病毒 水疱性口炎病毒,二、主要成员,狂犬病毒属弹状病毒科。 病毒粒子呈清楚的子弹形一端钝圆，一端平凹，长180nm，宽75nm，由囊膜和核芯两部分组成。,三、狂犬病毒（Rabies virus）,1.病毒粒子,G（糖蛋白） M2（基质蛋白） N（核蛋白） M（磷酸化蛋白） L（RNA多聚酶）,基因组为不分节段单股负链RNA，编码5种结构蛋白。,其中糖蛋白镶嵌于囊膜表面，能诱中和抗体并具有血凝特性。,2.病毒基因组,有5个血清型