检测蛋白质中氨基酸的含量的各种方法及优劣讨论.doc

蛋白质中氨基酸的含量测定组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，其含量测定是生化药品研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前其常用的测定方法有凯氏定氮法、福林酚法、双缩脲法、BcA法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法及荧光法。1凯氏定氮法11方法本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以氮转化为蛋白质的换算系数，即为蛋白质的含量。本法各国药典收载的方法一致。故参照中国药典2005年版三部41附录方法，按纯蛋白类供试品及添加无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品分别拟定各测定方法。12讨论121凯氏定氮法虽耗时较长，但它是蛋白质测定方法中最经典的测定方法，本法所测的结果为蛋白质绝对浓度而非相对浓度，可用于标准蛋白质含量的准确测定。122本法灵敏度较低，适用于O22o mg氮的测定，干扰少。123蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质的含氮量为16，故含氮量转化为蛋白质的系数为625。但由于不同蛋白质的结构差异，其换算系数会稍有区别，如乳制品为638，动物胶为5。65等，因此一些特殊蛋白质应在各论中相应说吩其转化系数。124在本法附注中起草了非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的测定，一般采用钨酸沉淀法，但当供试品中含有氨基酸(精氨酸)时，由于其会影响蛋白质的沉淀，故建议采用三氯醋酸沉淀法方法(1)与方法(3)的线性相关系数均能达到0999以上，较理想；方法(1)试剂配制繁琐且整个实验费时长，而方法(3)操作更简便快速。按各方法测试后的溶液放置30 min后重新测定其吸光度，3种方法溶液的吸光度均略有降低，结果变异均在1以内。根据上述考察结果，故本文参照国家药品标准地标升国标制定本法。2福林酚法(lowry法)21本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。本法各收载的方法中碱陛铜试液的配制、福林酚试液的酸浓度、测定波长及比色条件略有不同。本文对各种方法的线性、稳定陡进行了考察。22讨论221本法福林酚试液中使用的福林试液贮备液的配制在中国药典二部附录中有收载，其酸浓度为2 m01L，目前也有市售产品，但酸浓度可能有所差异，故应根据实际福林试液贮备液酸浓度的高低对最终福林酚试液的配制进行调整。222福林-酚试液仅在酸性pH条件下稳定，但第二步的还原反应只在pH=10的情况下发生，故当酚试剂加到碱性铜一蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生，否则会使显色程度减弱。223本法干扰物质较多，还原物质、酚类、柠檬酸、硫酸铵、s缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。234本法灵敏度高，比双缩脲法高100倍，通常测定范围为20250“g。3双缩腺法31本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与cu2+形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。本法各收载的方法中双缩脲试液的配制、测定波长及比色条件略有不同。本文对各种方法的线性、稳定性进行了考察。方法(1)与方法(3)的线性相关系数均能达到0999以上，较理想；方法(1)溶液的吸光度偏高同时其操作过程中需分别加入两种反应试剂，而方法(3)操作更简便，比色条件为室温。按各方法测试后的溶液放置30 min后重新测定其吸光度，方法(1)和方法(2)溶液的吸光度略有增加，方法(3)溶液的吸光度基本不变。32讨论321加人双缩脲试剂后需立即快速混匀。322本法测定较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，干扰物质较少，干扰测定的物质主要有：硫酸铵、s缓冲液和某些氨基酸等。323本法灵敏度差，测定范围为110 mg。4 2，2-联喹啉_4，4-二羧酸法(BCA法)41本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为cu+，BCA(2，2一联喹啉4，4一二羧酸)与Cu+结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。本法仅收载于欧洲药典60版、英国药典2009年版与美国药典32版附录中且方法基本一致。故本文参照国外药典制定本法。经试验，牛血清白蛋白对照品在8474236峭浓度范围内线性关系良好，吸光度为01870907，相关系数为0999 1。42讨论421本法显色后溶液吸光度随时间的增加而明显增加，故溶液显色后应于562 nm的波长处立即测定吸光度。422本法干扰物质少。但样品中不能有还原剂和铜螯合物，否则影响测定。423本法灵敏度较高，测定范围为80400斗g。5考马斯亮蓝法(Bmdford法)51本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G笛。与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。本法仅收载于欧洲药典6O版、英国药典2009年版与美国药典32版附录中且方法基本一致。故本文参照国外药典制定本法。经试验，牛血清白蛋白对照品在10591059斗g浓度范围内线性关系良好，吸光度为00050630，相关系数为09996。52讨论521本法测定吸光度时不可使用石英比色皿(因石英中的二氧化硅会与染色物结合，不易洗去)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95的乙醇荡洗，以洗去染色。522加入考马斯亮蓝G-2S0试剂来回翻转混匀时，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除，干扰测定。523本法显色后溶液不稳定，故溶液显色后应于595nm的波长处立即测定吸光度。主要的干扰物质有去污剂、Triton X-100、七二烷基硫酸钠(SDS)等，样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。524本法蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合物有更高的吸光系数，吸光度随蛋白质浓度的变化比福林-酚法要大。因而灵敏度高，可测定1200斗g的蛋白浓度。71。6紫外分光光度法61本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸：其在280nm波长处具最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。本法欧洲药典60版、英国药典2009年版与美国药典32版附录中均收载且方法基本一致，而中国药典2005年版未收载该方法，仅在国家药品标准中一些少量品种检查项下用于蛋白质的检查。本文参照国外药典及相关文献制定本法。62讨论621紫外分光光度法测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，但操作简便快速，适用于纯化蛋白质的微量检测，如用于柱层析洗脱液的快速连续检测，测定蛋白质浓度变化而不需要其绝对值或中间体的快速测定。622用对照品比较法测定蛋白质含量时，当供试品与对照品中酪氨酸和色氨酸含量差异较大时会产生一定的误差。故适用于测定与对照蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。623由于蛋白质吸收峰常因pH值的改变而有所变化，因此要注意溶液的pH值。624蛋白质浓度(mgmL“)=145A280一074A：，此公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。7小结71蛋白质含量测定方法中各国药典常用的对照品有牛血清白蛋白、人血白蛋白、酪蛋白、免疫球蛋白及各品种的自身对照品等。本文采用牛血清白蛋白对各测定方法进行了考察，建议在中国药典各论中应根据品种尽可能选用与品种蛋白质结构相近的蛋白质对照品。72本文建立的蛋白质含量测定