超氧化物歧化酶活性的测定.doc

植物生理学模块实验指导李玲 主编科学出版社超氧化物歧化酶的测定方法【实验目的】学习测定超氧化物歧化酶活性的方法。【实验原理】超氧化物歧化酶（SOD）普遍存在于动植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧阴离子自由基 （O2），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。超氧阴离子自由基（O2）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。超氧化物歧化酶催化以下反应：2 O2+ 2H+ H2O2+O2超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD活性。本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2。当加入NBT后，在光照条件下O2又可将NBT还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。当加入SOD时，SOD可通过清除O2，而抑制NBT的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。抑制NBT光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U）。【器材与试剂】1. 实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、微量移液枪、离心管、光照箱（光照度为4000lx）、指形玻璃管、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）2. 实验试剂0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.8）：配制方法见附录。酶提取缓冲液：称取77mg DTT、5g PVP，加入0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8），定容至100ml，摇匀，即得提取缓冲液（含5mmol/L DTT和5% PVP），低温（4）贮藏备用。50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）：配制方法见附录。130mmol/L L-蛋氨酸（MET）溶液：称取1.94g L-蛋氨酸，用50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）溶解，定容至100ml，充分混合（现用现配）。低温避光保存，可使用23d。750mol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.3mg NBT，用蒸馏水溶解，定容至100ml，充分混匀（现用现配）。低温避光保存，可使用23d。100mol/L Na2-EDTA溶液：称取37.2mg Na2-EDTA，用蒸馏水溶解，定容至100ml，使用时稀释100倍。低温避光保存，可使用810d。20mol/L 核黄素溶液：称取75.3g核黄素，用蒸馏水溶解，定容至100ml，使用时稀释100倍。低温避光保存，即用黑纸将装用该液的棕色瓶包好，现用现配。3. 实验材料经逆境处理的绿豆幼苗、芹菜或茶叶【实验步骤】1. 酶液制备取材，称取5g样品，置于研钵中，加入5ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4、12000g离心30min，收集上清液，低温保存备用，测量提取液总体积。2. 活性测定用5支玻璃管进行测定。按照表1所列内容加入各种溶液（注意最后加入核黄素溶液）。其中3支为测定管，2支对照管。混匀后将1支对照管置于暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应下反应15min后，立即置于暗处终止反应。以避光管作为空白参比调零，分别测定560nm处其他各管的吸光度。表1 测定SOD活性时各试剂加入量试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）1.7130mmol/L L-蛋氨酸（MET）溶液0.313mmol/L750mol/L氮蓝四唑（NBT）溶液0.375mol/L100mol/L Na2-EDTA溶液0.310mol/L20mol/L 核黄素溶液0.32.0mol/L酶液0.1对照2支试管以缓冲液代替总体积3.0【实验报告】1. 测定数据记录重复次数样品质量m/g提取液体积V/ml吸取样品液体Vs/ml560nm吸光度样品中SOD活性/UODcODs计算值平均值标准偏差1232. 计算0.5ODcVstm（ODc-ODs）V显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（ODs）和照光对照管反应混合液的吸光度（ODc）。以每分钟每克植物组织（鲜重）的反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%为一个SOD活性单位（U）表示。SOD=式中，ODc为照光对照管反应液的吸光度；ODs为样品管反应混合液的吸光度；V为样品提取液总体（ml）；Vs为测定时所取样品提取液体积（ml）；t为光照反应时间（min）；m为样品质量（g）。也可以每分钟反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%时所需的酶量为一个SOD活性单位（U）。【注意事项】1. 通过预实验，摸索显色反应所需的时间；2. 当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶液和核黄素除外）按比例混合后一次就加入2.6ml，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变，其余各步骤与上相同。3. 要求各管受光情况一致，所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。反应温度控制在25，视酶活性高低适当调整反应时间。温度较高时，光照时间应缩短；温度较低时，光照时间相应延长。