徐李圣开题报告定稿.doc

武汉生物工程学院毕业论文(设计)开题报告 题 目 名 称 野生食用菌凝集素的筛选及活性检测 题 目 类 别_ _ _ 毕业论文_ 系 别_ _生物技术_ 专 业 班 级_08级生物技术系本科一班_ 学 生 姓 名_徐 李 圣_ 指 导 教 师_ 邓 政 东_ 辅 导 教 师_邓 政 东_ 开题报告日期_ 2011年6月25日_ _ 研究现状：蕈菌（mushroom）又称伞菌，作为生物名称通常译作蘑菇，是指那些能形成大型肉质子实体的真菌，包括大多数担子菌类和极少数的子囊菌类，其富含蛋白质和氨基酸，具有降低胆固醇、增强免疫功能、抑制肿瘤、抗衰老等医疗保健作用1。凝集素（Lectin）是自然界广泛存在的一大类能凝集细胞、多糖或糖复合物的非源于免疫反应的糖蛋白，它能够特异性识别并可逆结合复杂糖复合物中的糖链，而不改变所结合糖基的共价结构。凝集素具有众多的生物活性，如凝集细胞的作用，免疫反应，细胞毒作用，作用于变异细胞以及发育细胞等，它已成为生物科学和临床科学非常有用的研究工具，并应用于临床诊断及治疗等。凝集素从发现至今已有100多年的历史，自从1888年俄国学者首次在蓖麻籽中发现凝集素后，凝集素的研究一直继续。1919年Sumner从豌豆中分离出结晶蛋白，命名为ConA，并用此方法第一次获得了纯的凝集素。1936年Sumner和However报道了ConA可以凝集血细胞和酵母细胞，也可以在溶液中沉淀糖原。蕈菌凝集素早在上世纪60年代至70年代，已对超过600 种高等真菌的提取物进行了测定，发现约30%具有凝集红细胞的活性。1994年Pemberton测定了403种采集于英国的蕈菌，发现约50%的蕈菌子实体提取物对人的红血球有凝集作用。越来越多的研究表明，凝集素是药用真菌中重要的药理成分2。食用菌凝集素的来源极其广泛，到目前为止，已经发现存在凝集素的食用菌包括双孢菇，金针菇，灵芝，香菇，牛肝菌等等，其中多数存在于菌类子实体中，而有的则在发酵菌丝体，子实体中都有分布。不同菌种来源的凝集素其结构组成，分子量，对糖血细胞的专一性，等电点等物化性质都会有所差异。目前，蕈菌凝集素研究的较少，全世界已经纯化的凝集素约有100多种，研究发现，大多数大型真菌凝集素具有很强的抗肿瘤活性。如双孢蘑菇凝集素具有抑制结肠癌细胞株HT29 、Coca22和乳腺癌细胞株MCF27的活性，金针菇、灵芝、口蘑凝集素具有抗肿瘤和免疫调节生理活性。为此，扩大筛选食用菌凝集素，研究其性质，可以更好地为食用菌产品的开发应用提供科学依据。研究目的和意义：凝集素广泛存在于植物、动物、真菌、细菌甚至病毒中。凝集素具有多种生物活性，可凝集各种细胞，活化淋巴细胞及对复合糖质具有沉降作用等，因而被作为生化及临床试剂广泛应用于研究领域。另一方面，部分凝集素具有免疫调节或抑制肿癌细胞生长的活性，从而增加了研究凝集素的意义。食用菌含有丰富的蛋白质、氨基酸、矿物质和维生素，不仅是美味佳肴，还具有许多独特的医疗作用，具有降低胆固醇、增强免疫功能、抑制肿瘤、抗衰老等医疗保健作用。从多种蕈菌的菌丝体或子实体中分离到的三萜类和多糖类物质具有调节寄主的免疫活性和抗肿瘤的作用。凝集素是另一类生理活性物质，部分凝集素能够选择性地抑制肿瘤细胞的生长并具有调节寄主免疫活性的作用。蕈菌凝集素的深入研究将进一步揭示蕈菌的药物学作用机制并为蕈菌产品的更广泛应用提供科学的依据。中国是蕈菌栽培最早的国家之一，也是生产大国，但多数蕈菌只是用于食用。蕈菌凝集素提取及红细胞凝集性能研究，有利于食用菌新品种的开发以及蕈菌凝集素在医学方面的研究。蕈菌凝集素主要存在于子实体中，且目前研究较少，故本研究验证几种常见蕈菌凝集素的性质，重点探讨蕈菌凝集素的分子特性，旨在为蕈菌食用安全及加工、蕈菌其它用途方面提供科学依据。研究内容（内容、结构框架以及重点、难点）：一、研究内容（一）蕈菌品种的选择（野生、栽培食用菌）。（二）蕈菌凝集素的粗提（20%-70%饱和度硫酸铵分级提取）。（三）凝集素凝血效果初测：血凝法。（四）选择凝血效果最好的利用DEAE2Sepharose FF 层析柱(116 cm 20 cm)，用含0.15mol/ L NaCl 的PBS 进行线性离子梯度洗脱，分部收集洗脱峰。 （五）按CBB - G250 法，以牛血清白蛋白为标准，测定蕈菌凝集素的蛋白浓度。（六）聚丙烯酰胺凝胶电泳，测定凝集素相对分子质量。（七）检测蕈菌凝集素凝集活性的种属特异性。2、 研究重点、难点（一）研究重点 1、蕈菌凝集素的提取、纯化、凝集活性的检测； 2、测定蕈菌凝集素的理化特性（蛋白质的相对分子质量、蛋白浓度、糖抑制性等）。（二）研究难点1、蕈菌凝集素的柱层析纯化；2、蕈菌凝集素蛋白质浓度测定；3、蕈菌凝集素蛋白质分子量测定。研究方法、手段：1、蕈菌凝集素提取取新鲜的蕈菌子实体 50g，洗净，剪碎，用PH7.2 0。05mol/L磷酸缓冲液（含0.14mol/L NaCl，称PBS）于4冰箱中浸泡24h，再经高速捣碎机捣烂后，4层纱布过滤，滤液3500r/min，离心30min，取上清液加入不同饱和度的硫酸铵沉淀（20%-70%），于4冰箱中静置过夜，离心同前。将收集到的沉淀物溶于PBS溶液，并以同一缓冲液透析至无(NH4)2SO4，风干浓缩即为食用菌凝集素粗品，备用。2、凝集素凝集活性的测定 （1）血细胞的采集与处理，配成2%细胞悬液。 （2）凝集活性的测定：在96孔“V”型血凝板中加入PBS25l，取样品25l作倍比稀释。每孔中加入25l 2%红细胞悬液，振荡均匀，室温放置1.5h后观察结果（20-70%梯度）。凝集素活力以产生血凝作用所需的最低凝集素浓度（微克/毫升）或最低浓度的倒数（微克/毫升）表示，亦可用凝集素样品的稀释倍数即效价表示。3、蕈菌凝集素分离纯化50 mL 上DEAE-Cellulose 柱，用不同盐浓度的PBS 溶液(0.02 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2)洗脱，在280 nm 的波长下检测，并记录下各个洗脱峰，洗脱峰用兔红细胞检测其凝血活性。活性部分收集， 浓缩后上Sephadex G-100柱进一步纯化，洗脱液仍用0.02 mol/L 的PBS洗脱， 同法检测，收集活性部分的洗脱液，用蒸馏水透析除盐，冷冻干燥，得到香灰菌凝集素纯品。分组做凝血鉴定，选出效果最好的一组利用考马斯亮蓝测定蛋白质吸收峰。4、按CBB - G250 法10 ，以牛血清白蛋白为标准，测定蛋白浓度（1）蛋白质标准曲线的制作；（2）凝集素粗制品的蛋白质浓度测定。5、蕈菌凝集素分子量测定 SDS-PAGE电泳检测蕈菌凝集素相对分子质量。6、检测蕈菌凝集素对鱼、牛蛙、鸡、兔红细胞的凝血效果，鉴定凝集活性的种属特异性。研究进度：2011.06.012011.08.31：资料查询；2011.09.012011.10.31：文献综述和开题报告的撰写、修改；2011.11.012011.11.15：各种材料和试剂仪器的准备及材料的预处理；2011.11.162011.11.30：蕈菌凝集素的提取、凝血活性的测定；2011.12.012011.12.31：蕈菌凝集素的筛选、提取工艺的优化；2012.01.012012.01.31：实验数据、结果分析；2012.02.012012.03.30：论文初稿的写作；2012.04.012012.04.30：论文修改、定稿.文献综述（包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等）凝集素（Lectin）是自然界广泛存在的一大类能凝集细胞、多糖或糖复合物的非源于免疫反应的糖蛋白，它能够特异性识别并可逆结合复杂糖复合物中的糖链，而不改变所结合糖基的共价结构。凝集素具有众多的生物活性，如凝集细胞的作用，免疫反应，细胞毒作用，作用于变异细胞以及发育细胞等，它已成为生物科学和临床科学非常有用的研究工具，并应用于临床诊断及治疗等3。1 食用菌凝集素的分布食用菌凝集素的来源极其广泛，到目前为止已经发现存在凝集素的食用菌包括双孢菇，金针菇，灵芝，姬松茸，香菇，牛肝菌，糙皮侧耳，草菇，等等4。某些种类只有在子实体内分布，而有的则在发酵菌丝体，干实体中都有分布。不同菌种来源的凝集素其结构组成，分子量，对糖血细胞的专一性等电点等理化性质都会有所差异。近年来，国内外对食用菌凝集素的研究也是不断升温，在我国福建，湖北等地都有杰出成果。凝集素在多数存在于菌类子实体中，而有的则在发酵菌丝体、子实体中都有分布。不同菌种来源的凝集素其结构组成，分子量，对糖血细胞的专一性，等电点等物化性质都会有所差异。凝集素的分布还与发育阶段也有一定相关性。在一些研究过的物种中，菌帽与菌柄的凝集素含量不同，对某些物种的体外菌丝培养证明凝集素不仅由孢子体产生，在培养基或冷冻磨碎的菌丝都能检测到凝血因子。BANNERJ EE 等在7 种高等真菌菌丝中发现了凝集素活性，并观察到其凝集血红细胞活性效应，他们认为在真菌菌丝中普遍存在着凝集素5。王贺祥等对常见22种食用菌菌丝提取物进行测定发现13种对兔血红细胞具有凝集活性6，认为食用菌是凝集素的重要资源，大约30%50%的食用菌中含有凝集素7。观察到凝集素含量会随着孢子体的生长阶段发生变化，不同的菌蕾和成熟担子菌显示不同的活性，不仅数量不同，特异性也不同。凝集素在真菌中的分布范围广，某些具亲缘关系的物种普遍含有大量凝集素成分，下面这些分类中是产蕈菌凝集素的分布：伞菌目61%，多孔菌目9%，红菇目15%，牛肝菇目10%，其它5%（革菌目0.96%，木耳目0.33%，鸡油菌目0.64%，榛菌目1.6%，钉菇目0.33%，马勃菌目0.96%）8。2、凝集素的结构和特征目前已经获得纯化的凝集素中，阐明氨基酸序列的并不多，多数是对甘露糖(或葡萄糖)专一的凝集素。从结构上看， 已分离的凝集素中有单亚基的，也有多亚基的；有的为简单蛋白，有的为糖蛋白；相对分子质量从12 000190 000不等，但多为低相对分子质量的蛋白或糖蛋白，分子量变化范围约为10kDa100kDa，亚基数目为24个。现已知道，凝集素与糖的结合是通过其分子中肽链的活性部位，即专一结合糖的区域实现的，与凝集素分子中共价结合的糖无关。凝集素至少应该具有2个与糖结合的位点，而且结合是可逆的。对已知真菌凝集素的氨基酸序列进行比较，可以看出某些真菌凝集素具有较高的同源性，如草菇凝集素、灵芝凝集素和金针菇凝集素的同源性约为60% 70%9。研究还发现有些真菌凝集素的氨基酸序列有较高的同源性，但由于个别区域氨基酸的有无，可以使其生物学功能存在一定的差异，这正是猴头和姬松茸凝集素无促进淋巴细胞分裂活性的原因10。真菌凝集素由依赖共价键相连结的蛋白质和糖两个部分组成，蛋白质占的百分比大，糖的含量较少或无，一般都是由几个单糖构成寡糖链，寡糖链再以两种方式与蛋白质肽链相连，分别构成N-连接(糖链与肽链中的天冬酰胺的酰胺氮相连)和O-连接(糖链与肽链中的丝氨酸或苏氨酸的羟基氧相连)的糖蛋白 11。凝集素中蛋白质占的百分比大，糖占的百分比少，一般含糖量为0%-30%。研究表明凝集素是通过其分子肽链中的活性部位参与细胞间的识别等生理生化过程，它与受体表面糖基的结合是通过其专一结合糖的区域来实现的，与凝集素分子中共价结合的寡糖链无关12。凝集素具有可逆的糖结合特异性，即其凝集活性可被单糖或寡糖所抑制。植物凝集素的分离、提纯及相关生物活性测定，一直是研究者关注的热点。具体的分离纯化方法目前有很多种，基本上都是按照蛋白质分离方法进行。一般先将提取物经硫酸铵分级沉淀，然后通过阴离子或阳离子交换层析 13。已经成功实现凝集素纯化的实验表明，采用盐析沉淀、离子交换层析、凝胶过滤分子筛技术和聚丙烯酰胺电泳技术可以对大部分的蕈菌凝集素进行纯化14。3、凝集素的生物活性凝集素具有多种生物活性，可凝集各种细胞，抑制肿瘤生长，促进细胞有丝分裂，活化淋巴细胞，激发免疫调节因子表达等等 15。蕈菌凝集素由于其丰富的生物学功能，备受研究人员的重视。目前，主要研究的是蕈菌凝集素的免疫调节功能，从体内试验到体外试验对凝集素免疫调节功能进行研究。Qing Bai She等人研究发现草菇子实体以及发酵菌丝体中的凝集素具有免疫调节作用，能促进白细胞介素-2，干扰素-的生成。但迄今为止，该方面的研究只限于人及少数动物，还没有推广到普通的蕈菌。在免疫学上，蕈菌凝集素还是不可缺少的促淋巴细胞有丝分裂剂。在神经学科上，研究神经元表面结构，外周神经元损伤带来的后果及其修复机制，细胞神经递质受体等。曾经有科学人员发现用糙皮侧耳子实体中分离得到的凝集素具有抑制小鼠进食功能，对于活化因子以及抗进食活性凝集素的作用机理尚不清楚16。蕈菌凝集素免疫调节抑制动物肿瘤增殖的功能研究也是另外一个热点。通过给荷瘤小鼠注射蕈菌凝集素，观察荷瘤小鼠腹水瘤和实体瘤增殖的变化，初步确定蕈菌凝集素的抗肿瘤活性。已有的研究结果表明，鹿角炭角菌、茶树菇、蒙古口蘑、糙皮侧耳、砖红绒盖牛肝菌、香菇、黄绿蜜环菌和灵芝等凝集素均对小鼠接种的腹水瘤细胞株Sarcoma-180和肝癌细胞株Heptoma-22有明显的抑制作用17。蕈菌凝集素还有对病毒增殖的抑制作用， 主要是通过蕈菌凝集素对病毒的某些特异性的酶进行抑制来实现。有不少的研究结果表明，蕈菌的凝集素可以抑制植物病毒如TMV 的增殖18。M。Batterbury等人发现双孢菇凝集素能抑制眼睛纤维原细胞的增殖，其抑制效果与凝集素浓度成相关而且没有明显的毒性19。接受青光眼手术的病人，其手术的成败很大程度上取决于术后伤疤的愈合情况，伤疤完全愈合会导致闭塞纤维化，从而堵塞眼结膜空间无法调节眼睛内部压力，愈合度过低则会导致压力过低以致失明，利用双孢菇凝集素控制伤疤愈合过程，从而提高青光眼手术的成功率。4、存在的问题虽然从蕈菌中获得的抗病毒蛋白对植物病毒有很好的防效，但由于存在抗病毒效果持续时间有限的问题，从而限制了这些物质的进一步开发利用，期间应用进展依然缓慢。目前从食用菌中获取的大多数小分子类抗植物病毒剂都是粗提物，成分未能确定，抑制机理不明确，还有待深入研究。核糖体失活蛋白除了本身所具有的抑制蛋白质合成的活性以外，还有抗肿瘤活性以及对酶的降解活性。这些活性为我们带来了一定的启示，如抑制反转录酶活性，这种活性的存在对于控制某些依赖反转录酶进行复制的病毒无疑将是可行的。目前从蕈菌中分离纯化的核糖体失活蛋白的种类和数量都很有限，但功能同植物核糖体失活蛋白具有相似性，应用前景仍需要进一步探索。5、展望凝集素是蕈菌中一类非常特殊的蛋白质，具有促进有丝分裂、免疫调节、抗增生、抗肿瘤、扩张血管和降血压等功能，已成为细胞学家、肿瘤学家、心脑血管专家尤其是免疫学家研究的焦点。我国是蕈菌栽培最早的国家之一，也是生产大国，具有丰富的蕈菌资源，但多数蕈菌只是用于食用，关于食用菌凝集素的研究仍然处于基础阶段。关于其在生物学方面的功能，我们可以借鉴植物凝集素进行深入研究。食用菌免疫调节蛋白是一类具有类似免疫球蛋白结构和免疫调节功能的小分子蛋白质，人们对它的生物学特性、免疫调节功能和分子生物学研究有浓厚的兴趣，尤其是随着分子生物学和生物工程技术的迅速发展，利用工程菌株的培养获得大量重组免疫调节蛋白的研究取得了一些进展。深入开展对食用菌免疫调节蛋白的结构、功能和工程菌高效表达的研究具有重要的意义和应用价值，相信食用菌免疫调节蛋白的开发利用将具有广阔前景20。主要参考文献：1 章剑 蕈菌凝集素的提取及红细胞凝集性能研究D.武汉生物工程学院学士学位论文,2010.2 刘艳如, 余 萍, 郑 怡. 12种食用菌凝集素的筛选J. 福建师范大学学报(自然科学版), 2003, 2(19):65-68.3 吴恩奇, 图力古尔. 蘑菇凝集素及其研究进展J. 菌物研究, 2006, 4(4): 69-76.4 赵 曦. 茶树菇凝集素的分离纯化及部分性质的研究D. 四川大学硕士学位论文, 2005.5 BANNERJ EE PC , GHOSH A K, SEN GUPTA S.Hemagglutinationg activity in ext ract s of mycelia f rom submerged mushroom cultures J . Appl Environ Microbiol , 1982 ,44 (4) :1009-1011.6 王贺祥, 黄荣春, 吴子斌, 等. 覃菌凝集素J . 中国食用菌, 1997 , 16 (1) :324.7 Batterbury,M.Tebbs,C.A.Rhodes.J.M. Agaricus bisporus(Edible Mushroom Lectin) Inhibits Ocular Fibroblast Proliferation and Collagen Lattice Contraction. Experimental Eye ResearchJ. 2002, 74(3): 361-370.8 汪何雅, 苑艳辉, 钱 和. 食用菌凝集素的研究进展J. 2005,4:8-12.9 Ho JC, Sze SC, ShenWZ, et al. Mitogenic activity of edible mush2room lectins. Biochem BiophysA