院校资料]3 电泳技术基础医学与医学实验技术.ppt

第五章 电泳技术 Electrophoresis,基础医学院 刘芸,1,内容提纲,纸电泳 凝胶电泳 等电聚焦电泳 荧光差异双向电泳技术（DIGE） 毛细管电泳技术,2,一、定义,电泳：带电粒子在直流电场中向着与其本身所带电荷电性相反的电极移动的现象。 电泳技术：生物样品在电泳过程中因各组分的移动快慢不同而被分离的技术。利用电泳现象进行物质分离的技术。,第一节 电泳技术概论,3,4,二、电泳分析技术发展概况,1809年 发现电泳现象 1937年 Tiselius 自由界面电泳 1948年 Wieland 滤纸电泳 1959年 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1980s 毛细管电泳 (capiliary electrophoresis),Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 蒂塞利乌斯(瑞典人)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖,1948,5,三、电泳分析技术的分类,1. 根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳 2. 根据电泳电压的高低 常压电泳 100500 V 高压电泳 50010kV,6,滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳,3. 根据电泳中是否使用支持物,自由电泳不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳使用支持物,(1) 按支持物的物理性状不同，可分为,7,(2) 按支持物的装置形式不同，可分为 平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳,8,9,10,11,12,13,14,连续pH电泳指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳。 不连续pH电泳指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段有不同的pH，如 PAGE、IFE。 优点：在不同 pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。,4. 根据电泳系统pH是否连续，可分为,15,四、电泳技术的特点,凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分 离,并可进行定性或定量分析; 样品用量极少; 设备简单; 可在常温进行; 操作简便省时; 分辨率高.,16,五、电泳技术应用,临床诊断 进行血清蛋白、血红蛋白、精蛋白、脂蛋白的分离、鉴定和含量测定以及血清学酶的检验、免疫化学检验等。 工业制造 用于提纯酶、激素及其它生化产品 基础理论研究,从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。,17,六、电泳的基本原理,悬浮或溶解在电解质溶液中的带电粒子，在电场作用下以不同的速度向着与自身所带电荷极性相反的电极移动。在电泳过程中，带正电荷的粒子向电场的负极方向移动，带负电荷的粒子向电场的正极方向移动。移动的带电粒子受到电场力和周围介质阻力的作用，当二力平衡时，粒子以稳定的速度向电极方向移动。由于电荷、质量等的差异，粒子将会有不同的质/荷比，使其在电场中具有不同的迁移速度。,18,以蛋白质分子为例:,19,V q M = = E 6r,迁移率（Mobility) 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。,20,七、影响电泳速度的因素,1. 电场强度（E）,E电流热效应支持介质上的水分蒸发样品的热变性 E电泳速度慢延长电泳时间样品扩散区带模糊不清分辨率下降,常压电泳 100500 V 1V/cm10V/cm 高压电泳 50010kV 20V/cm200V/cm,21,溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。 I缓冲能力越大缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少电泳速度减慢,2. 离子强度（I）,（m：离子的摩尔浓度，Z：离子的价数）,对于稀溶液：,22,pH值决定了化合物解离的程度，也决定了物质所带的净电荷。,3. 缓冲液的pH,23,氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）,NH2,(pK1),(pK2),等电点 (isoelctric point)：当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值。,24,- + +（液）- 负极 正极,4. 电渗效应,电渗（electro-osmosis）指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。,25,5. 分子筛,在凝胶电泳中，分离蛋白质等物质除了利用所带电荷的差异的效应外，还利用了其分子量的不同及形状不同。,6. 温度,电泳时电流通过支持介质会产生热量。按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比（Q=I2Rt）,26,第二节 常用电泳技术,（一）纸电泳,滤纸电泳 （paper electrophoresis）是指用滤纸作为支持载体的电泳方法。,滤纸水平地架设在支持板上。把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。最初用于蛋白质，后来也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物质，其优点在于或采用滤纸与色素结合的直接电泳图，或剪下滤纸的任何部分来抽提其中的物质。,27,薄膜电泳（衍生）,支持体：薄膜 优点： 1.吸附作用小；2.电渗作用小；3. 需加样量少；4. 亲水性小 应用：广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析,Magnification of Cellulose Acetate filter,28,支持物：多孔凝胶。如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高。,（二）凝胶电泳,凝胶电泳 （agarose gel electrophoresis）是指用凝胶物质作为支持载体的电泳方法。,最常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳 原因：机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳； 连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳,29,30,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳不受蛋白质原有电荷影响，主要取决于蛋白质及其亚基分子量大小的方法，可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。,31,基本原理 SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键 。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,32,SDS-PAGE是一个不连续系统，由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。 浓缩胶（pH6. 8，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提高分离效果。 分离胶（pH8. 8，孔径小） 通过分子筛效应和电荷效应，把 样品中的各组分按分子量和电荷 的大小而分开。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,33,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,34,PAGE（ polyacrylamide gel electrophoresis ）即聚丙稀酰胺是由丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸胺（AP）激发的。,SDS-PAGE的有效分离范围,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,35,考马斯亮染色 银盐染色,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,36,琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）,琼脂糖Agarose，缩写为AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶素或琼胶糖。是一种天然的线状高分子，是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是 D-半乳糖 和3 ， 6- 脱水-L 半乳糖。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌处理。,37,琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。,琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）,这类载体能使被筛分的物质保持活性，并能迅速活化并接上各功能基团，架构疏松，孔径大，是一种很好的电泳凝胶，刚性比聚丙烯酰胺大。,38,（一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、 病毒等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性,琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）,39,（二）缺点 1. 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2. 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3. 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。,琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）,（三）应用,1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标,40,基本原理 pH为8.38.0时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。,例：琼脂糖凝胶电泳分离核酸,41,基本操作步骤：,例：琼脂糖凝胶电泳分离核酸,42,常用仪器设备,例：琼脂糖凝胶电泳分离核酸,43,常用仪器设备,例：琼脂糖凝胶电泳分离核酸,44,（三）等电聚焦电泳,等电聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis，IEF） 是指电泳系统中加进两性电解质载体，当通以直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。样品（蛋白质等）进入时，不同的蛋白质移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。,45,优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白质或多肽的等电点。 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白质。,等电聚焦电泳的特点,46,等电聚焦电泳的基本原理,蛋白质具有许多可解离的酸性基团（COOH）和碱性基团（NH2）及其它基团，在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质分子在不同pH下的解离状态,47,等电聚焦电泳的基本原理,在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。,没通电时的变化,引入电场时的变化,电泳结束后的变化,48,+ pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn - a b c 蛋白质分子在负极端 蛋白质分子在正极端 蛋白质样品中各组分聚焦成区带,在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。,等电聚焦电泳的基本原理,49, 有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度 有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合 电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带,进行等电聚焦电泳必须具备三个条件：,50,Bio-Lyte 两性电解质,在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率。,等电聚焦电泳pH梯度的选择：,51,（四）双向电泳,双向电泳（two - dimensional electrophoresis，2-DE）广义定义是将样品进行电泳后针对不同目的在它的直角方向再进行一次电泳。目前双向电泳大多是指第一向为等电聚焦，第二向为SDS-PAGE电泳。,52,DNA RNA 蛋白质,3个层次的调控,转录水平调控,翻译水平调控,翻译后水平调控,蛋白质存在复杂的翻译后修饰，作为生命功能的行使者，它比基因更能直接地反映生理过程及其变化。蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象复杂性的真实体现。,背景知识,（四）双向电泳,53,随着人类基因组计划重点由结构基因组到功能基因组的转移，生命科学开始进入后基因组时代。 研究基因终产物及生命活动直接功能执行者蛋白质的科学-蛋白质组学（Proteomics）应运而生。,背景知识,（四）双向电泳,54,蛋白质组最早是由澳大利亚Macquarie 大学的Wilkins和 Williams在1994年的意大利举办的双向电泳会议上首次提出来的。,背景知识,（四）双向电泳,Proteome一词由“蛋白质（PROTEin）”与“基因组（genOME）”杂合而成，对于“基因组学（Genomics）”，“蛋白质组学”定义为一个基因组所表达的全套蛋白质。由Proteome进一步派生出Proteomics。,55,蛋白质组学概念：是通过大规模研究蛋白质的表达水平的变化、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互作用的整体综合信息的科学研究。,背景知识,（四）双向电泳,56,（四）双向电泳,蛋白质组分析的首要要求,将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。,57,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,58,（四）双向电泳,59,IPGphor IEF Unit,DALT Six Unit,（四）双向电泳,60,双向电泳法是OFarrall和Klose分别在1975年根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。 1. 第一向等电聚焦：IEF是根据蛋白质的等电点（pI）的不同而将他们分离的一种电泳技术。蛋白质在环境pH 值低于pI 时带正电，高于pI 值时带负电。在加上电压的情况下，蛋白质会向其最稳定的状态即等电点位置移动。,双向电泳的基本原理,61,2. 第二向SDS-PAGE：SDS PAGE是根据蛋白和多肽的分子量大小将其分离的。它是在含有十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶中进行的。由于SDS 掩蔽了蛋白本身所带的电荷，同时形成了阴离子复合物，使单位质量的蛋白带有大约相等的阴离子电荷。,双向电泳的基本原理,62,等电聚焦流程图,水化,加样,聚焦参数设置,（四）双向电泳,63,第二向SDS-PAGE,SDS-PAGE 电泳由四步骤组成： 1) 灌胶 2) 在SDS 平衡缓冲液中平衡胶条 3) 将平衡好的胶条放置在SDS 凝胶上 4)第二向电泳系统的准备并进行电泳,（四）双向电泳,64,样品制备原则,样品制备是双向电泳中最关键的一步，质量的好坏将直接影响2-DE结果。尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：,1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失； 2）减少对蛋白质的人为修饰； 3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。,65,样品制备需要的试剂,样品制备需要四种主要的试剂： 1. 离液剂：主要包括尿素和硫脲； 2. 表面活性剂，也称去垢剂：早期常使用NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS等双性离子去垢剂； 3. 还原剂最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP） 4. 其它：可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA、PMSF 或 Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。,66,一般样品处理过程,1. 细胞破碎、避免蛋白水解、样本分级 2. 蛋白质沉淀和去除干扰物质 3. 裂解：样本制备过程会使用高浓度尿素（或联合使用尿素和硫脲）和一种或多种去污剂。,67,荧光差异双向凝胶电泳技术 （ Difference gel electrophoresis , DIGE ）,68,背景知识,69,DIGE ( Difference gel electrophoresis ) 技术最早在 1997 年由 Jon Minden 实验室的 Unlu等提出，后来 Amersham Biosciences成为此技术的主要推动者。 2002 年 Gharbis 等巧妙的将所有实验组的样品等量混合为内标用在每块胶上。不久，Amersham公司便将内标作为DIGE实验设计核心原则之一 ，从而使DIGE 发展成为更加趋于成熟的体系。,背景知识,70,精确：高灵敏度确保在统计可信度范围内能够鉴别出可能检测到的真实的蛋白表达最小差异。用Ettan DIGE可以常规检测到95%。 标准化：Ettan DIGE利用内标最大程度降低实验间偏差和得到有效的数据以得出更精确的实验结论。 重复性：极佳的定量重复性和更准确的量化蛋白表达数据 高效：多个样品在同一块胶上同时共分离，大大提高通量，简化分析过程并极大减少实验操作时间。 简化：完整，易于使用的系统，可以完全整合到蛋白质组工作流程中。 经过验证的：在过去3年中，2-D DIGE技术已经在全世界超过50家居于领导地位的研究部门使用。,Ettan DIGE相对于传统2-D的显著优势,71,EttanTM DIGE 的组成,2-DE Unit,CyDye DIGE荧光标记物,DeCyder差异分析软件,Typhoon Imager or EDI,72,1. CyDye DIGE 荧光标记物,73,1. CyDye DIGE 荧光标记物,74,Why we use the internal standard?,75,Benefits of the internal standard,76,2. 2-DE Unite,77,3. Scanners,78,4. 分析软件,79,80,图3-12 三个荧光通道图谱以及叠加后图谱 Figure 3-12 Images of three fluorescence channels and their overlay image. A: HEK293-TAG-PRAK cell line without stimulation, Cy3 B: HEK293-TAG-PRAK cell line stimulated by NaAsO2 ,Cy5, C: internal standard, Cy2 D: overlay of A and B.,81,传统电泳存在的缺陷？ 不能克服因高电压引起的焦耳热！ 引发的问题： 分离效能低 分析时间长,（五）高效毛细管电泳,82,毛细管的特点：,比表面积大,散热快,可以用很高的电压,分析速度加快,分离效能提高,（五）高效毛细管电泳,83,高效毛细管电泳（High-performance capillary electrophoresis, HPCE）是在一根内径为25-75m，长几十厘米熔融石英玻璃毛细管内进行的电泳。,（五）高效毛细管电泳,是在外加电场的作用下，在毛细管中按荷电粒子淌度或分配系数的差异而进行分离的新技术。,84,（五）高效毛细管电泳,85,毛细管电泳的基本原理,1、恒压下的电泳 （1）电泳速度（Electrophoretic Velocity, ） v =L/t :荷电粒子电泳速度（cm/s）; L:荷电粒子迁移的距离; t:荷电粒子迁移的时间 v =Ld/t Ld：荷电粒子通过毛细管的有效长度（毛细管进口端到检测器的距离）,86,（2）淌度（电泳迁移率，Electrophoretic mobility,e） e=V/E e: 电泳迁移率，单位 ：厘米2/伏特秒；E:电场强度 e=q/6r q:荷电粒子的静电荷；:溶液黏度；r:荷电粒子半径 对于一定的荷电粒子或离子，淌度是该粒子的特征常数。,毛细管电泳的基本原理,87,2、偶电层 固体与液体接触时，固体表面分子离解和表面吸附溶液中的离子，在固液界面形成相对固定和游离的两部分离子层，称为偶电层。 在毛细管电泳中，不论是带电粒子的表面还是毛细管壁的表面都有偶电层。,毛细管电泳的基本原理,88,毛细管壁（以熔融石英毛细管柱为例）：pH3时， SiOH+H2O SiO-+H3O+,紧密层,扩散层 ,Zeta电势w,89,界面,吸附层,3、电渗流（Electroosmotic flow, EOF） （1）定义：在毛细管中，电渗流指溶液在外加电场的作用下整体朝一个方向运动的现象。,EOF,+,-,毛细管电泳的基本原理,90,（2）电渗流的速度、方向 A. 电渗流淌度： eo= w/ 4 veo= Ew/ 4 电渗的大小受到Zeta电势和介质粘度的影响，一般说来，Zeta电势越大，粘度越小，电渗流值越大。在不少情况下，电渗流的速度是泳流速度的5一7倍。 B.电渗流方向： 在通常的熔融石英毛细管区带电泳中，电渗流由正极流向负极。,91,电渗是毛细管内液体及其中所有组分共有的现象，包括溶剂、各种溶质（带电离子与中性分子）,电泳是毛细管内带电离子的特有现象，中性分子无电泳现象,92,（3）显示淌度 既然同时存在着泳流和渗流，那么，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内电介质中的运动速度应当是两种速度的矢量和，即： v总= v + vEOF = e +eo 称为显示淌度，为粒子自身的电泳淌度和由电渗引起的淌度之和。 = e +eo= v总/E=LdLt/tV Ld是毛细管总长度；V是外加电压；Lt为进样端到检测器之间的毛细管长度，或称为迁移长度。,93,（4）毛细管电泳中，离子迁移的顺序 v总= v + vEOF 正离子：电泳方向与电渗流方相同，最先流出； 中性粒子：电泳速度为零，随电渗流流出。 负离子：电泳方向 与电渗流方向相反； v v EOF，无法流出 v v EOF，在中性粒子后流出,-,+,-,N,N,N,N,N,N,N,EOF,94,毛细管电泳的分离模式,95,（1）毛细管区带电泳,毛细管区带电泳（CZE）也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管电泳中最基本也是应用最广的一种操作模式，通常把它看成其它各种操作模式的母体。 在CZE中，一般需要控制的操作变量主要是电压、缓冲液及其pH值和浓度、添加剂等，而在实际样品分折中，则应注意迁移时间的重复性、定量校正因子和最小检测限等。,96,（2）胶束电动毛细管色谱（MECC),Terabe在1984年首先将大于临界浓度（CMC)的离子型表面活性剂加入缓冲液中进行电泳，发展成为胶束电动毛细管色谱。,胶束的形成 离子型表面活性剂在水相中，如果浓度足够大，则表面活性剂的疏水基团就结合在一起，形成“胶束”。这种“足够大浓度”即胶束的临界浓度(CMC)。,阴离子表面活性剂： 十二烷基硫酸钠（SDS) 形成的胶束,97,2、机理 在MECC系统中，实际上存在着类似于色谱的两相： 一是流动的水相； 另一是胶束相(准固定相）； 溶质在这两相之间分配系数不同，从而实现分离。,1、特点： 使毛细管电泳在用于离子型化合物分离的同时能进行中性物质的分离。,（2）胶束电动力学毛细管色谱（MECC),98,EOF,+,-,使用阴离子表面活性剂： 具有不同疏水性的粒子与胶束的相互作用不同， 疏水性强的作用力就大，其留在胶束相中的时间就长；因胶束相的绝对速度很小，故组分的保留时间就长； 疏水作用较弱的组分，停留在胶束相中的时间短，则保留时间较短； 如果使用阳离子表面活性剂，则情况相反。,EOF,EOF,EOF,EOF,EOF,EOF,99,3、常用的表面活性剂 （1）阴离子表面活性剂 （表面活性部分带负电） （2）阳离子表面活性剂 （表面活性部分带正电） （3）两性离子（同时带有正、负电荷） （4）非离子型表面活性剂（亲水基由一定量的含氧基团如醚基、羟基构成）,应用较多,100,四类表面活性剂中典型化合物的性质,101,（3）毛细管凝胶电泳,在毛细管中填充凝胶或其它无胶筛分介质进行电泳的技术。,1、特点： 主要用于生物大分子的分析。 柱效极高，理论塔板数达百万甚至上千万级。 按样品分子大小进行分离。,2、机理： 凝胶由颗粒网状结构和共聚在其中的溶剂所组成，具有多孔性，有类似于分子筛的作用，能将物质按照分子的大小逐一分离。,102,3、常用凝胶及无胶筛分材料 凝胶材料：葡聚糖、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖等。 无胶筛分材料：甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等。,4、应用 DNA测序； 寡核苷酸核DNA内切片段分析； PCR扩增产物分析； 蛋白质分离和分子量测定。,103,（4）毛细管等电聚焦,根据蛋白、多肽类物质的等电点进行分离的毛细管电泳技术。,1、特点： 可分离等电点差异小于0.01pH单位的两种蛋白质。,2、机理 将两性物质混合物及要分离的蛋白组分充入毛细管，在两个缓冲液储瓶中阳极端放酸，阴极端放碱，施加电压后两性物质在毛细管中形成pH梯度，蛋白迁移到与其等电点相同的pH位置时电荷为零，迁移停止，从而“聚焦”在该位置，与其它不同等电点的蛋白质实现分离。 “聚焦”完成后，通过向毛细管两端加压或向一个缓冲液储瓶加盐，使蛋白组分依次通过检测器。,104,（5）毛细管电色谱,在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、键合色谱固定相，使样品根据它们在色谱固定相与流动相之间吸附、分配的不同而实现分离分析的电泳技术。,105,1、进样系统 可采用静压力进样（入口端加压、出口端抽真空、虹吸进样）或电动进样 2、分离系统 由毛细管、恒温系统、高压电源（030KV可调电压） 3、检测系统 4、数据处理系统,毛细管电泳仪的基本构造,106,（1）毛细管柱,A. 几何尺寸： a. 内径： 细柱的优点：一是减小电流，因此减少自热 二是增大散热面积。 缺点：比表面积大，吸附严重。又会造成进样、检测和清洗等技术上的困难。 因此,目前一般采用25-75um的毛细管柱。,107,b. 管长: 短柱容易造成过热，但分析时间能大大缩短； 柱长增加，柱效随之增加，但由于操作电压的限制， 柱长也不能无限增加，同时又要以降低电场强度、增加分析时间为代价。 柱子长短根据实际情况而定。,c. 管壁厚度: 壁厚由两部分组成，一是石英本身，二是涂在外面的聚酰亚胺。 市售的管子通常有两种规格，一种是厚壁的，石英管外径375um；另一种是薄壁的，150um。外壁都还有一层几微米的聚酰亚胺涂层，聚酰亚胺的热导率很低，厚壁管有助于改善整个散热环境，也能减少聚酰亚胺对散热的不利影响。,108,石英玻璃毛细管直观示意图,检测窗,聚酰亚胺涂层,石英毛细管,使用时,109,B. 形状： 通常柱子都是圆管型的。,C. 材料： 理想的毛细管柱应是化学和电惰性的，紫外光和可见光可以通过，有一定的柔性，易于弯曲，耐用而且便宜 毛细管柱的材料可以是聚四氟乙烯、玻璃和弹性石英等 聚四氟乙烯可以透过紫外光，不用另开窗口，它有电渗，但很弱，主要缺点是很难得到内径均匀的管子，对样品有吸附，热传导性差，在使用过程中有变性现象，因此，应用范围不广 玻璃的电渗最强，但有杂质 目前采用的毛细管柱的材料主要是石英，其表面杂质少，存在电渗。,110,高效毛细管电泳的应用领域,蛋白、多肽、核酸等生物大分子的分析 中药领域 手性分子分析 临床药理研究 食品工业,111,M 蛋白的筛检与鉴定是诊断多发性骨髓瘤和waldenstrom 病等单克隆免疫增殖病的重要依据,常规的初筛方法包括醋酸纤维膜电泳和琼脂糖凝胶电泳等。 CZE法：缓冲液: 0.15mol/L的硼酸 氢氧化钠缓冲液，调pH值至10；待检血清3000rpm离心5min，以pH7.5的磷酸缓冲液作稀释20倍后取20微升上样。,1、蛋白、多肽、核酸等生物大分子的分析 （1）氨基酸、肽和蛋白质的分离；,112,（2）蛋白质、多肽的纯度鉴定 人生长激素 ()：是一重要的蛋白质类药物 ，在该产品的研究、生产和质量控制中 ，起到了重要作用。但此蛋白质的少许脱氨基变异很难被检测出来，Frenz等利用HPCE（CIEF、CZE）分析了hGH和脱一个氨基、脱二个氨基的hGH ，获得良好的，使纯度鉴定结果更为可靠。 糖蛋白类药物：大多是由一组不同糖型的糖蛋白组成 ，糖型不同，疗效也不同，因此在生产过程的质量控制中 ，监测其不同的糖型很是重要。 利用HPCE对重组人红细胞生成素、重组人干扰素等蛋白的监测也已有报道。,113,（3）蛋白质、多肽的性质研究 等电点的测定：CIEF（毛细管等电聚焦电泳） 分子量的测定：CGE（毛细管凝胶电泳） 稳定性研究：MECC（毛细管胶束电动色谱）,114,（4）蛋白质、多肽的结构分析 蛋白质、多肽经酶解后 ，用HPCE分离所得“指纹图谱”可提供蛋白质及多肽的结构信息。 Frenz等分别利用HPLC和HPCE对胰蛋白酶降解的rhGH进行分析 ，HPLC大约用时 150min , HPCE用时 12min ;在HPLC色谱图中没出现的峰在HPCE中出现了，收集HPLC中的单峰 ，再在HPCE中运行 ，出现了两个峰。此研究结果表明，HPCE是肽图分析中更有效的工具。,115,蛋白质,肽片段混合物,酶切,CZE,分离,特征性肽图,微量制备,CE,分别测定各片段的氨基酸序列,整个蛋白质 的一级结构,CE应用举例-肽的分析,116,（5）蛋白质、多肽药物的药代动力学研究 蛋白质、多肽类药物用量小 ，体液浓度低 ，给检测带来困难。另外 ，体液中存在多种蛋白质，有些蛋白质与药物结构非常相似，更是给分离带来困难。具有高的分辩率和灵敏度 ，在蛋白质、多肽类药物的药代动力学研究中有独特优势。,（6）临床上监测体内蛋白质、多肽的动态变化 体内蛋白质、多肽含量的变化与人的疾病密切相关 ，Hiraoka 等运用MECC分析了脑脊液中低分子量蛋白质 MG( Mr11700 )、TP (Mr12300)、骨磷脂碱性蛋白 (Mr18000)、TP(Mr2300030000)和1 酸性蛋白 (Mr42000) ，并对其中 MG和 TP进行了定量测定 ，与某些疾病的发生进行相关分析。,117,（7）核酸分析 包括碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、引物、探针、单链 DNA、双链 DNA(DNA片断、PCR产物 )分析。 CZE和 MECC通常用来分离碱基、核苷、核苷酸、简单的寡核苷酸等。CGE则可用于寡核苷酸 (1 0 mers)、ss DNA和 ds DNA等的分离。,（A）碱基、核苷和核苷酸的分析 （B）纯度检测、片断收集和微量制备 （C）PCR产物分析和 ds DNA分析 （D）蛋白 -DNA反应测定 （E）基因突变测定,1