橄榄开花期其雌蕊的形态学.docx

橄榄开花期其雌蕊的形态学、组织学和超微结构的变化摘要 高等植物主要进行有性生殖。从生物学角度看，在大多数经济果树种类中，受精保证了果实的形成，所以有性生殖这一过程是极其重要的。然而，尽管橄榄具有很高的农业价值，但是人们很少研究其有性生殖。为了研究橄榄在受精前，调节他花粉雌蕊相互作用的细胞和分子机制，首先应该了解相互作用涉及的生殖结构。本实验研究了从花骨朵里幼嫩雌蕊的生长到花瓣凋落、很容易看到的柱头衰老的整个过程，确定了橄榄雌蕊的解剖学和超微结构变化。我们已经将一系列已经定义好的花的发育阶段的变化联系起来，并且确定了直到开花期开始，橄榄的雌蕊结构才完全成熟，可以接受花粉。现在，我们的结果清楚地显示在开花的不同阶段其组织学和超微结构的变化。我们要讨论在受精前，观察到的变化是否会影响，或者被花粉雌蕊相互作用影响。引言长期以来，许多领域都对橄榄很有兴趣，植物学、农学、园艺学文献中都常常出现橄榄。开花行为的相关知识给预测橄榄产量，研究产量诱因和潜在的规则都提供了有效数据。具有经济效益的植物种类其开花事件是根据花的生物气候学定义的。生物气候学主要研究花发育的时间机制（经常重复出现的生物事件），针对生物和非生物因素开花时间的诱因，相同种类不同阶段之间的相互作用。橄榄每次开花数量很多，且大量的花都是前一年形成的，长于营养枝叶腋处圆锥状花序上。橄榄是雄花和两性花同株的种类，所以同一个花序上有两性花（长有雌蕊和雄蕊），雄花（只有雄蕊）。橄榄开花阶段的生物气候学时间已经被一系列发育阶段或者生物气候学阶段所描述，发育阶段是随着花序、果枝、总的树群中不同阶段的比例反映花芽发育阶段的。然而，单朵花的发育阶段还没有完全给定义了。橄榄成花发育学的研究已经大体上进行了园艺学上的定位，主要是追踪影响开花时间的生理学和环境方面的因素，同时还有不同品种之间花的生物气候学阶段差异。很少的一些雌蕊形态学已经描述了开花期雌蕊的特点，或者，只研究了子房结构和受精成功相关的过程，但是没有系统的研究连续的发育变化。柱头是雌蕊最重要的部分，一般包括柱头主体和分泌区域。分泌区域包括成行的称为乳突的分泌细胞。柱头的基本区域连接着乳突和花柱的运输组织。其外表面是可接受面，在这里花粉粒会着附。如果植物的柱头是湿润的，表面细胞会释放分泌物来捕获花粉粒这种分泌物对花粉的水合作用和萌发都具有重要意义。在花柱中，外周皮质组织包围，支撑，保护着中间的运输组织，同时，他和子房心皮细胞层是连续的。外周皮质组织包含两个侧面的管状结构连接着柱头和子房组织。是实心花柱的雌蕊，内部结构是不同于运输组织的，被穹状结构分隔，内部结构中，纵向成排运输组织的分泌细胞的分泌物形成胞间基质。这种基质中有很高的酯酶和磷酸酶活性，类似于中空花柱种类花柱管道中的粘液。花柱中运输组织提供花粉管生长所必须的营养和前体物质，另外，花柱具有支撑、引导和信号作用。不同的植物种类中，生殖过程中存在于雌蕊的淀粉的重要性，开花质量的主要决定因素之一，已经有报道。淀粉对花粉管的生长、胚珠发育和随后的产量都是很重要的。之前我们已发现，在橄榄中，雌蕊由一个湿润的两裂片的柱头，一个实心花柱，一个包含有4个胚珠的两室子房。目前，我们已经研究了橄榄雌蕊的发育，从开花前到开花期结束的已定义好的连续的开花阶段，研究了他的形态学、组织学和超微结构，分析了这些阶段中观察到的变化。材料和方法 植物材料 为了观察花器官的发育，20042008年每年的五月到六月份，从生长于Granada and Crdoba(Spain)两个省的Olea europaea L. trees, cv.Picual获取两性花。每一年，每20棵树随机选择并标记一个花枝。开花期初，为了使花样本的发育阶段标准化，第一天将选定花枝上先前已经开放的话摘掉；第二天，花苞仍然未开放的也摘掉；这时，花枝上只剩下同时开放的花苞。确定好的花苞会被取样以用来之后的分类和研究。另外，没开放的样本花苞也会取来，通过其大小和颜色确定发育阶段。取样会持续1015天，这取决于收获那一年，因为开花极易被环境因素影响，例如：温度和降雨量。立体显微镜检查挑选的不同发育阶段的花苞和花朵置于M165FC(Leica, Germany)立体显微镜下，并用高分辨率的数字相机拍照。显微观察的样本处理 从花朵中摘下雌蕊，4下，用含4 % (w/v)多聚甲醛和2 % (v/v)戊二醛的0.1Mol，pH7.5的二甲砷酸钠缓冲介质固定过夜。像之前描述的，固定后，所有样本都要用二甲砷酸钠缓冲介质冲洗几次，用乙醇溶液脱水，包埋于Unicryl树脂中。组织化学测定法用RM2164旋转显微用薄片切割机切成1m厚的薄片，用0.05 % (w/v)的甲苯胺蓝染色用于整体组织学观察。观察碳水化合物，切片用碘酸希夫试剂染色。观察中性脂类用苏丹黑染色。用Axi-oplan 显微镜的高分辨率相机拍照，得到显微图片。橄榄雌蕊不同发育阶段和组织（柱头的乳突细胞和乳突下细胞、花柱中的薄壁组织和引导组织、子房的心皮和胚珠）中淀粉含量测定已完成。我们用的是之前Rodrigo和等人的方法，并进行了一些修改。简单地说，彩图转换成黑白图片，然后用v.3.0图像工具软件计数黑白图片上淀粉颗粒的光密度。通过不断增加观察水平来确定灰色临界值，直到二维图像和原始图像上染色淀粉颗粒完全吻合，避免细胞壁产生的误差。切片储存，并用于之后所有测量。因此，每一个切片都会获得一个淀粉的二维图像，每一个像素的光密度都要测量。所有像素的总和被用来衡量图像中淀粉含量。1mm2面积上拍照得到的30幅图片上的平均差和标准差用计算机计算。电子传输显微镜 Ultracut E显微镜用薄片切片机切取超薄切片（7090nm），先用5 %(w/v)的醋酸双氧铀染色，接着用1% (w/v)的氢柠檬酸铅染色。JEOL TEM-1011电子传输显微镜观察切片。用MegaView III相机的iTEM软件拍下图片。形态测定分析 运用图像工具v.3.0软件测量雌蕊尺寸。每一个发育阶段取15个雌蕊，测量柱头、花柱、子房的高和宽。用Office Excel 2007软件计算平均差和标准差。结果不同开花阶段相关的橄榄雌蕊形态特征雌蕊的差异和花的差异及其相关，所以有必要用花形态特点来推断雌蕊的发育。我们要选择连续的、容易观察的形态学特征，例如：花瓣与萼片的颜色和位置，其他情况（如膨压和开裂），以及雌蕊上柱头的出现或缺失。依据这些标准，我们将植物开花期分为9个阶段：（1）小的绿色花苞，一半被萼片包被，其他部分处于四分染色体时期。（2）稍微大一点的绿色花苞，萼片包被着四分之一的花苞。（3）花瓣长于萼片的乳白色花苞。（4）花苞张开，能看到黄色花药。（5）花朵开放，花瓣展开，与花轴成直角。花药饱满，可以看见绿色柱头，但子房仍然隐藏于花朵中。（6）花药开裂，露出黄色成熟花粉粒，很快，柱头表面就可以看到花粉粒。（7）花瓣和花药下垂，褐色的花药皱缩，柱头变黄是由于花粉覆盖在柱头表面。（8）花粉和花瓣凋落，只有萼片仍然环绕在子房基部，柱头结构完整，保护很好，但是顶端开始变暗。（9）柱头和花柱变成褐色，萎缩。橄榄树开花是不同步的，整个植物园的受精阶段长达一周之久。每一个柱头的接受能力会有23天，但是在开花第一天接受能力最强，这与分泌量达到峰值是吻合的。因此，我们把花苞紧闭时期看做受精前，花药萎缩和花瓣凋落则在受精之后。绿色花苞转变为乳白色需要大约3周，开始于花药发育的四分体时期。花药萎缩和花瓣凋落发生于花药开裂的34天，一旦受精成功，子房会在随后的23天内明显膨大。图1b显示的是对应于花的每个发育阶段，雌蕊的形态特征。在成功受精之后，子房显著膨大；或者是受精失败时，子房仍然相对较小。当花药发育良好，并包含四分小孢子时，子房是最容易观察到的，这些四分小孢子形成于花粉母细胞减数分裂之后。因此，雌蕊相对于雄蕊发育延缓，雄花器官和雌花器官形成时间就存在差异。在整个开花期，随着雌蕊三个不同部分不断的生长和发育，雌蕊也不断变大。雌蕊会长高，直到授粉阶段，然后保持这个高度直到授粉完成；然后，柱头和花柱皱缩，变小，最后凋落，与此同时，受精成功后子房显著增大。起初，柱头和花柱非常短，两个柱头裂片很类似。开花期，柱头有两种不同的裂片，乳突特别容易认出来，最开始，花柱的高和粗相近，但是很快，花柱长高两倍多但是几乎变粗。在整个研究过程中，各个阶段，子房没有明显变化。受精前，子房增大主要是在开花期初，在此之前和之后，变化后很小。一旦受精，子房迅速增大，但是当受精失败时，子房生长停止，凋落。柱头发育阶段的组织化学和超微结构的变化在雌蕊发育的最初阶段，授粉前，两裂片的柱头被成排的长、有液泡、多细胞的乳突细胞包围，这些乳突细胞中有一些小的淀粉粒和薄的细胞壁（Fig 3a）。这时，乳突细胞表面有一层很薄的包含脂质的柱头分泌物。开花期，两柱头裂片分离，乳突细胞看不到淀粉颗粒。（Fig 4a b）。因为两柱头裂片的物理分离和伸长的、肿胀的乳突细胞的加速分离，柱头表面显著增大。柱头分泌物变得非常丰富，并形成了一薄层覆盖在柱头表面，填充乳突细胞间隙。（Fig 4b）。这种复杂的胞间基质（ECM）很容易被PAS和苏丹黑染色，表明其中有多糖和脂质。（Fig 4b c d）。里面的乳突下细胞都朝向实心花柱的核心，这个漏斗状区域很容易被区分，极易被PAS染色（Fig 4a），不能被苏丹黑染色（Fig 4c）。漏斗状区域在柱头最下部和花柱最上部相接处的部位最粗，并由上到下朝向子房不断变薄。在授粉期，可以看到大量花粉粒嵌在维管组织的复杂胞间基质，但是他们并不直接和乳突细胞接触（Fig 4e f）,紧跟着花粉萌发，花粉管穿透胞间充满ECM的乳突细胞。受精结束后，乳突表现出衰老特征，极易被甲苯胺蓝（Fig 5a）和PAS（Fig 5b）染色，但是不能被苏丹黑染色(Fig 5c)。猪头分泌物仍然很多，但是其形态已经改变了，变成膜状（Fig 5d）。柱头表面仍然有许多花粉粒，但是多数凋萎，不具萌发的能力（Fig 5e）。花柱和子房发育阶段组织化学和超微结构变化在雌蕊发育早期，在观察的许多部分中，花柱主要的输导组织并不太容易看到，可能是因为他还没有分化完全（无数据显示）。仅仅是在开花期前，运输细胞由花柱周围薄壁细胞分化而来，并伸长。花柱的疏导组织连接着柱头和胎盘上的双房子房，指明了花粉管路径。同样，我们在花柱实质中观察到大量大的淀粉颗粒，然而在维管束附近传递细胞只有很少量的淀粉（Fig 6a）。胚珠积累了较大颗粒的淀粉，而中果皮中是小颗粒（Fig 6b）。在花柱中，传递细胞不能因为脂质而被染色（Fig 6c）.在子房中，中果皮很容易因为脂质而被染色，胚珠周围空间内果皮内层细胞和胚珠之间。（Fig 6d）。整个雌蕊中，除了胚胎和胚珠，其韧皮部和周围细胞，都很容易因脂质而染色。（Fig 6c d e）。整个花柱和子房表皮细胞最外层是一薄层、连续的包含多糖和脂质的外皮。（Fig 6f）。开花期，中果皮和传递细胞中淀粉含量增加（Fig 7 a b），同时，脂质能够染色的部分保持不变。（Fig 7 c d）。胚芽不含淀粉，却含有大量脂质，极易染色。（Fig 7 b d）。外皮变薄，伸长的输导组织细胞（含有胞间连丝和含有大量淀粉的造粉体）细胞壁变薄，（7e - h）。总果皮也含有大量淀粉(Fig. 7 h)。花柱输导组织和子房口之间没有特殊的结构，比如闭塞体，或之类的。授粉后，花柱的主要组织化学特征是疏导组织中没有淀粉了。(Fig. 8 a)。在膨大的子房中，我们发现造粉体和淀粉含量显著下降和缺失，珠孔很容易被PAS染色。(Fig.8 b, c)。输导组织逐渐变得和周围花柱组织区别不明显，最终柱头凋萎，朝向花柱组织(Fig. 8 d, e).。内果皮和中果皮细胞体积增大，液泡体积明显变大(Fig. 8 f, g)。在这个阶段，内果皮较外边的部分、维管束周围很明显可以看到大量离散的石细胞，从而将中果皮和内果皮分离。(Fig. 8 f)雌蕊发育过程中淀粉变化我们通过PAS染色后测定淀粉颗粒的光密度确定了雌蕊发育各个阶段的淀粉含量。(Fig. 9 )。数据显示了淀粉积累量的标准曲线，然后，耗尽所有测量雌蕊组织中的淀粉。在柱头中，在第三阶段（即将开花时），乳突细胞中的淀粉含量达到顶峰，在开花期，乳突下细胞中淀粉含量达到顶峰。(Fig. 9 a)。花柱中淀粉含量高于柱头，其实质组织在开花期前达到峰值，输导组织在开花期或者授粉期达到峰值(Fig. 9 b)。授粉阶段，胚珠和果皮中淀粉含量迅速达到峰值，然后二者跌至平均水平，并保持稳定。讨论雌蕊分化和花发育直接相关，因此从外面可见的花的形态特征来推理连续的雌蕊发育阶段是可以的。本研究中选择的标志是很容易看得到的，使我们容易建立雌蕊发育的9个阶段。先前的研究确认和用到的是橄榄开花阶段，但是这些针对的是整个树的开花物候学，因此必须是以花发育不同阶段花群体行为为基础的，而不是单独的一朵花。本研究，各开花期的结构变化表明，首先，柱头和子房的发育要比花柱快很多；雌蕊在开花期初始发育完成，此时授粉作用刚刚开始。橄榄的栽培品种成熟雌蕊有这样的特征，湿柱头和实心花柱。另外，齐墩果属的其他成员如Syringa vulgaris的雌蕊结构与橄榄的类似。橄榄的湿柱头是由于柱头乳突细胞产生的分泌物。柱头分泌物和其他因素（例如酶活性：酯酶和磷酸酶活性）决定了柱头在不同阶段的接受能力。在橄榄雌蕊的发育过程中，电子显微镜下可以看到胞外分泌物的数量、位置和形态发生了巨大变化。首先，在开花期初始，乳突细胞的分泌量很少。后来，随着花药开裂，大量分泌小泡前体，包含有蛋白质、脂质、多糖。最后，当花药和花瓣都脱落时，柱头分泌物仍然很充沛，只是其复杂基质成为膜状。柱头的接受能力可以持续几个小时到几天，这取决于植物种类。在橄榄中，我们观察到花药仍然肿胀时，花粉粒在橄榄柱头上萌发，这表明，这种植物柱头的接受能力开始于花完全开放时。(stage 5)。临近开花期(stage 3)和花完全开放时(stage 5)雌蕊不同组织中淀粉的最大含量也是预示开花期雌蕊成熟，做好了授粉和受精的准备。之后，淀粉含量的下降证实了橄榄授粉和受精时间非常短，或许只有几个小时。与花药开裂一致，柱头上萌发花粉的数量迅速增加，表明此时柱头接受能力最强。橄榄这个过程持续2436小时，取决于环境因素，如温度。在柱头接受能力最强时，橄榄柱头乳突细胞结构完整，没有任何凋溶迹象，与先前其他种类的研究报告形成对照。因此，是乳突细胞的细胞膜和细胞壁分泌柱头分泌物。橄榄柱头接受能力的消失是与乳突细胞的退化相伴随的，正如以前关于杏的研究。授粉期间，我们观察到，橄榄花粉外壁和柱头分泌物紧密接触。橄榄花粉外壁和柱头分泌物含有大量脂质，这一现象预示这些脂质可能在花粉水合作用和萌发过程中发挥了巨大作用，花粉管定位中也发挥了作用，以前研究同样也是湿柱头的其他物种中也是这样的，例如烟草。柱头乳突下细胞形成漏斗状，在花柱上端较下端要大一些。我们发现漏斗状区域在物理上和生理上连接着柱头下面的内部区域花柱的疏导组织和胎座，这种结构预示着花粉管通路是由花柱到子房。在橄榄雌蕊中，观察花粉管的生长，也证实了漏斗状区域中的花粉管数量在较窄较低的区域、紧挨着输导组织上端减少，这支持了假说花粉管通路阻塞发生于这一组织。普遍发现，在柱头和花柱之间有漏斗状区域的组织都表现为配子体不亲容，这样只有兼容的花粉管能达到子房。所有这些观点都表明，当配子体不相容时，兼容花粉管的选择过程主要发生于柱头基部中心，进入花柱疏导组织的门户。在橄榄中，只有一到两个花粉管能穿透到达子房小室中，导致子房中的四个胚珠只有仅仅一个或者两个能受精成功。我们观察到漏斗状乳突下细胞区域由上往下是与花柱的疏导组织相连的，这支持了假说柱头和疏导组织结构限制了到达胚珠的花粉管数量。在一些植物种类中，一个叫闭塞物 的东西调节着花粉管透过可以因为碳水化合物和蛋白质染色的分泌物进入子房的时间。在阿月浑子属中，花粉管进入子房通过一个突起，这是一个桥，形成于花柱和胚珠之间索节最上边的区域。橄榄中，我们没有观察到特殊的类似闭塞物的结构。这一缺失提示橄榄雌蕊在开花期是完全成熟的，所以没有必要要控制花粉管进入子房的时间。橄榄中，疏导组织是直接到达胎座的，为花粉管进入胚珠提供通路。我们也观察到珠孔有含有碳水化合物的分泌物，正如之前对其他物种中描述的。这种珠孔分泌物可能当做营养物，吸引花粉管直接到达珠孔。在之前关于橄榄雌蕊的研究中，成功的受精后随之而来的是果实形成，这一过程子房起了很大的作用，因此子房吸引了大部分人的眼光。柱头开始老化，花瓣凋落表明收分作用结束，但是并不一定就表明受精发生了。柱头和花柱的衰老与凋亡发生于雌蕊发育的最后阶段，不管受精与否。子房迅速膨大时受