小儿哮喘与树突状细胞免疫分子表达异常关系研究.doc

芀芈薃羀罿蒃葿薇肂芆莅薆膄蒁蚄蚅袄芄薀蚄羆蒀蒆蚃膈节蒂蚂芁膅螀蚁羀莁蚆蚁肃膄薂蚀膅荿蒈虿袅膂莄螈羇莇蚃螇聿膀蕿螆节莆薅螅羁芈蒁螅肃蒄莇螄膆芇蚅螃袅蒂薁袂羈芅蒇袁肀蒀莃袀膂芃蚂衿羂肆蚈衿肄莂薄袈膇膄蒀袇袆莀莆袆罿膃蚅羅肁莈薀羄膃膁蒆羃袃莆莂羃肅腿螁羂膈蒅蚇羁芀芈薃羀罿蒃葿薇肂芆莅薆膄蒁蚄蚅袄芄薀蚄羆蒀蒆蚃膈节蒂蚂芁膅螀蚁羀莁蚆蚁肃膄薂蚀膅荿蒈虿袅膂莄螈羇莇蚃螇聿膀蕿螆节莆薅螅羁芈蒁螅肃蒄莇螄膆芇蚅螃袅蒂薁袂羈芅蒇袁肀蒀莃袀膂芃蚂衿羂肆蚈衿肄莂薄袈膇膄蒀袇袆莀莆袆罿膃蚅羅肁莈薀羄膃膁蒆羃袃莆莂羃肅腿螁羂膈蒅蚇羁芀芈薃羀罿蒃葿薇肂芆莅薆膄蒁蚄蚅袄芄薀蚄羆蒀蒆蚃膈节蒂蚂芁膅螀蚁羀莁蚆蚁肃膄薂蚀膅荿蒈虿袅膂莄螈羇莇蚃螇聿膀蕿螆节莆薅螅羁芈蒁螅肃蒄莇螄膆芇蚅螃袅蒂薁袂羈芅蒇袁肀蒀莃袀膂芃蚂衿羂肆蚈衿肄莂薄袈膇膄蒀袇袆莀莆袆罿膃蚅羅肁莈薀羄膃膁蒆羃袃莆莂羃肅腿螁羂膈蒅蚇羁芀芈薃羀罿蒃葿薇肂芆莅薆膄蒁蚄蚅袄芄薀蚄羆蒀蒆蚃膈节蒂蚂芁膅螀蚁羀莁蚆 小儿哮喘与树突状细胞免疫分子表达异常关系研究目的 比较哮喘患儿与正常DCs表达协同刺激分子(B7-1和B7-2)和主要组织相容性复合体分子(MHC和类分子)的水平，研究小儿哮喘的免疫学发生机制。方法 分离DCs，采用酶免疫标记技术分别检测并比较各组DCs协同刺激分子（B7-1和B7-2）、主要组织相容性复合体分子（MHC和类分子）表达率。结果 DCs细胞表面B7-1表达率在哮喘组高于对照组，分别为26.027.26%和18.175.21%，差异具有显著性（p0.05)。DCs表面MHC-分子表达率在小儿哮喘组和对照组分别为52.0212.18%和58.629.26%，差异不具有显著性（p0.05）；DCs表面MHC-表达率在小儿哮喘组和对照组分别为56.268.37%和61.0811.95%，差异不具有显著性(p0.05)。结论 小儿哮喘的免疫学发生机制与DCs协同刺激分子表达功能异常密切相关。关键词 小儿哮喘，DCs，协同刺激分子， 主要组织相容性复合体Study on the Relationship Between Asthma in children and the Immuno-molecular Abnormal Expressions of DCsABSTRACTObjective By comparing the different expressions of immuno-moleculars of DCs between asthma in children and control, so to study the immune mechanism of asthma in children. Methods DCs were isolated from all the surveys, immune lable technique were performed to detected the expressioons of co-stimulatory molecules and MHC molecules on the surface of DCs. Results The expression of B7-1 on DCs from asthma in children was higher than that from control group, they were 26.027.26% and 18.175.21% respectively, while the expression of B7-2 was seen a reverse tendency, 9.222.15% and 16.183.81%， respectively. The expression rates of MHC I molecule on the surface of DCs from asthma in children and control group were 52.0212.18% and 58.629.26% respectively, and the difference has no statistical meaning. About MHC molecule, it was seen the same result between the 2 groups, and the expression rates of asthma in children and control group were 56.268.37% and 61.0811.95% respectively. Conclusions The immune mechanism of asthma in children was related to the abomormal expression of immuno-moleculars of DCs. Keywords asthma in children, co-stimulatory molecular, major histocompatibility complex.1材料与方法1.1一般临床资料2008年2月-2009年1月我院儿科门诊经临床确诊为哮喘患者108例为实验组，年龄51.2岁；选择同期正常儿童120例为对照组，年龄51.5岁。1.2材料鼠抗人CD1单克隆抗体、（华美生物工程公司），羊抗鼠二抗、B7单克隆抗体、MHC分子单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），淋巴细胞分离液（军事医学科学院），T淋巴细胞亚群检测试剂盒（北京邦定泰克生物技术公司）。1.3 DCs分离无菌采集人外周抗凝全血，转移至含有等量淋巴细胞分离液的试管中，1000rpm离心20分钟，将淋巴细胞分离层细胞移至另一无菌试管，加入Hanks液后1000rpm离心15分钟，弃去上清，以微量RPMI1640完全培养基混悬沉淀细胞，调细胞浓度至1108/ml， 375%CO2培养4小时，弃去上清，用细胞培养液洗去未贴壁细胞，再加入含10%胎牛血清的完全细胞培养基，同时以终浓度分别为100u/ml和200u/ml加入GM-CSF和TNF-，于培养2天后备用1。1.4 DCs表达协同刺激分子（B7-1和B7-2）检测1.4.1取上述细胞悬液涂于洁净玻片（每一标本分别于玻片两端滴加一滴），用吹风机快速吹干，滴加固定液于标本，固定1分钟后用Hanks液冲洗3遍，甩干。1.4.2 分别于两端加入鼠抗人B7-1和B7-2单克隆抗体20ul，置湿盒37作用1小时。尔后用Hanks液冲洗3遍。1.4.3 加羊抗鼠IgG二抗10ul于标本，置湿盒37作用30分钟，再用Hanks液冲洗3遍。1.4.4. 加入APAAP复合物10ul，置湿盒37作用30分钟，用Hanks液冲洗3遍。1.4.5 滴加碱性磷酸酶底物显色：取少许坚固红加入底物液中，充分混匀。取上述溶液20ul加于标本上，37作用1小时用Hanks液冲洗终止反应。1.4.6 滴加苏木素一滴复染1分钟，Hanks液冲洗。1.4.7计数：油镜下观察细胞表面有桔红色标记物的细胞为阳性细胞，无桔红色标记物的细胞为阴性细胞，计数100个单个核细胞计算CD56阳性细胞百分率。1.5 DCs表达主要组织相容性复合体分子（MHC和类分子）表达率。方法同上，以MHC和类分子替代B7-1和B7-2即可。1.6 统计学处理方法SPSS11.5软件对结果进行统计学处理，两组均数比较采用t检验，检验水准取双侧=0.05。2结果2.1 DCs表达协同刺激因子（B7-1和B7-2）检测结果DCs表面B7-1表达率在实验组和对照组分别为26.02%和18.17%，差异具有显著性（p0.05)。结果见下表1。表1 小儿哮喘组和正常对照组DCs表达协同刺激分子检测结果(%)组别B7-1（xs）B7-2（xs）哮喘组26.027.26*9.222.15*对照组18.175.2116.183.81*表示与对照组比较，p0.05）；DCs表面MHC-表达率在实验组和对照组分别为56. 26%和61.08%，差异不具有显著性(p0.05)。结果见下表2。表2 小儿哮喘组和正常对照组DCs表达辅助分子检测结果(%)组别MHC-（xs）MHC-（xs）哮喘组52.0212.1856.268.37对照组58.629.2661.0811.953讨论小儿哮喘是严重困扰儿科医师的一常见儿童及婴幼儿呼吸系统疾病。其发病原因复杂，目前多认为其与机体的免疫应答状态有关，但其确切机制不明。本研究通过测定并比较研究组和对照组DCs表达免疫分子的不同，探讨其可能的免疫学发生机制，从而为小儿哮喘的预防和治疗提供策略。DCs 是目前体内功能最强大抗原提呈细胞，既可以活化CD4+T细胞，又能活化CD8+ T细胞。DCs活化特异性免疫细胞的需要双信号刺激，其中B7分子及其配体的结合为其活化提供协同刺激信号。B7分子包括两类：B7-1 和B7-2。B7 分子与T 细胞上的CD28 和CTLA-4 互为受配体。B7-1 和B7-2 均可与CD28 或CTLA-4 结合,但是B7-1 和B7-2 与CD28 和CTLA-4 结合的决定簇不同。B7-1 与CD28 的亲和力是B7-2 的23 倍。与CTLA-4 的解离率也低于B7-2 。B7-1 和B7-2与CD28 结合后,可促进T 细胞的增殖,而两者与CTLA-4 结合后则下调免疫应答2 。研究结果表明：小儿哮喘患者外周血DCs表面B7-1表达率（26.027.26%）高于对照组(18.175.21%)，差异具有统计学意义（p0.05）。而B7-2表达率分别为9.222.15%、16.183.81%,在两组间表现为相反的趋势，提示小儿哮喘患者DC可能通过高表达B7-1这种协同刺激分子，并通过其与CD28分子的结合，活化免疫活性细胞，并使免疫应答向细胞免疫方向分化，以此提高患者体内的细胞免疫应答强度。进一步证实小儿哮喘发生的免疫学原因是机体免疫应答介导的细胞免疫过程，而这一过程的免疫学发生机制与DCs表达B7分子异常有关系。DCs活化免疫细胞除需要协同刺激信号外，其表面MHC与抗原肽复合物同T细胞表面TCR与CD4或CD8的结合也为其活化提供重要信号。研究结果表明，来源于小儿哮喘组和正常对照组DCs表面的MHC-类分子和MHC-类分子表达一致。MHC的主要功能是在抗原呈递细胞内，通过与低分子量抗原肽结合，以MHC-抗原肽复合物的形式将抗原信息呈递给T淋巴细胞，为T淋巴细胞活化提供第一活化信号3。研究结果提示：在小儿哮喘中，DCs的抗原呈递作用并未增强，由DCs刺激的细胞免疫排斥反应主要由协同刺激分子异常，最终导致Th0细胞向Th1方向分化，导致出现Th1偏离。研究结果提示，小儿哮喘的免疫学发生机制与DCs功能异常密切相关。由于DCs表达协同刺激分子B7-1升高，而B7-2表达降低，通过DCs细胞表面B7-1与T细胞表面配体CD28分子的结合，刺激免疫应答向细胞免疫方向分化强度增加，导致出现以细胞免疫应答为主的超敏反应的发生。参考文献1斯东锋，岳嘉宁，杨勇，等.大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养J.上海交通大学学报：医学版，2007，27(6)：755-7582 Wakim J， Nico R，et al. Dendritic Cell-Induced Memory T Cell Activation in Nonlymphoid Tissues J. Science, 2008,319(5860) :198-2023 Jacobs B， Wuttke M，Papewalis C，et al. Dendritic cell subtypes and in vitro generation of dendritic cellsJ. Hormone and Metabolic Research , 2008, 40 (2): 99-107 衿芁莁螀羈莃薇蚆羇肃莀薂羆膅薅羁羅莇莈袇羄葿蚄螃羃腿蒆虿羃芁蚂薅羂莄蒅袃肁肃蚀蝿肀膆蒃蚅聿芈蚈蚁肈蒀薁羀肇膀莄袆肇节薀螂肆莅莂蚈肅肄薈薄膄膇莁袂膃艿薆螈膂莁荿螄膁膁蚄蚀膁芃蒇罿膀莅蚃袅腿蒈蒆螁膈膇蚁蚇袄芀蒄薃袄莂虿袂袃肂蒂袈袂芄螈螄袁莆薀蚀袀葿莃羈衿膈蕿袄衿芁莁螀羈莃薇蚆羇肃莀薂羆膅薅羁羅莇莈袇羄