高效体积排阻色谱法测定黄秋葵多糖相对分子量与分子量分布.doc

高效体积排阻色谱法测定黄秋葵多糖相对分子量与分子量分布裘雅渔1 李巧玲1 程和勇2(1浙江大学化学系，浙江 杭州310027；2 杭州师范大学材料系，浙江 杭州 310058)摘要 目的：建立黄秋葵多糖的相对分子量与分子量分布分析方法。方法：应用体积排阻色谱法，色谱柱为TOSOH TSKgel-G4000PWXL (7.8 X 300 mm,made in Japan)，流动相为0.3M硝酸钠溶液(内含0.02M叠氮钠)，柱温：40 ，示差折光检测器(检测器温度40)，流速08 mlmin-1 。结果：根据建立的方法测定，得到黄秋葵多糖的高效凝胶色谱图，计算出黄秋葵多糖的相对分子量及其分布。结论：所用方法简便、快速、准确，可用于黄秋葵多糖的质量控制。关键词：高效体积排阻色谱法；黄秋葵多糖；相对分子量及其分布文章分类号：O65Determination of the molecular weight(Mw)and weight distribution(Mw distribution)in Okra polysaccharide by HPSEC-RID QIU Ya-yu1，LI Qiao-ling1，CHENG He-yong2(1 Department of Chemistry，Zhejiang University , Hangzhou，310027 China;2 Department of Materials，Hangzhou Normal University，Hangzhou ,310058 China)Abstract Objective：To establish the method of analysis the molecular weight(Mw)and weight distribution (Mw distribution) of Okra polysaeeharideMethods：Using HPSEC-RID method，chromatographic condition inc1uding TOSOH TSKgel-G4000PWXL (7.8 X 300 mm,made in Japan)column，the mobile phase is consisted of 0.30M Na2S04(including 0.02M Na2 N3)at 40 of the column and the RID detectorResults：All the molecular weight(Mw)are between 32500 and 34500 and al1 the distribution width are below 2.0conclusion :This method is simple，rapid and accurate for the control of Okra polysaccharideKey Words：HPSEC-RID；Okra polysaeeharide；the moleeular weight(Mw)and weight distribution(Mw distribution)黄秋葵多糖是从黄秋葵嫩荚果中发现并分离出一种低分子量活性多糖。嫩荚果中，含有特殊香气和风味的粘滑汁液，这种粘滑汁液是由水溶性纤维果胶、半乳聚糖和阿拉伯树胶等组成，具有神奇的功能，这种粘滑汁液即是粘蛋白1,具有保护肠胃、肝脏和皮肤粘膜作用2。并有治疗胃炎、胃溃疡等疾病的效果3；这种粘液蛋白还能刺激中枢神经，加速血液循环及促进新陈代谢和全身血管活化4，可防治因血管供血不足造成的心脏病、中风、骨质疏松及老年痴呆等疾病5。多糖的分子量不是均一的，具多分散性，需要用统计方法表征其平均分子量及其分子量分布6。体积排阻色谱(SEC)法采用化学惰性的多孔物质为固定相，按样品中各个组分相对分子质量大小实现分离。另外，熵驱动的SEC分离机制，最大限度地降低了分析物与固定相间的直接作用，大大简化了分离条件，仅使用温和的流动相和简单的洗脱条件就可以实现分离。目前SEC已被广泛应用于多糖大分子的分离7。采用SEC色谱分离的方法排除复杂样品基质的干扰，就可以实现更准确的测量。体积排阻色谱法测定多糖的分子量及其分布，具有快速，重现性好等优点在国内外得到了广泛的应用8。黄秋葵多糖为水溶性多糖9，针对其单糖组成和空间结构与葡聚糖相似，在色谱柱的选择上倾向于更适合于水溶性多糖分离测定用的TOSOH TSKgel- G4000PWXL (7.8 X 300 mm,made in Japan，葡聚糖的排阻极限为1106 Dalton )。有关黄秋葵多糖的平均分子量及其分子量分布甚少见相关报道，本文应用体积排阻色谱(HPSEC-RID)法测定黄秋葵多糖的平均分子量及其分子量分布10，为黄秋葵多糖产品质量控制提供了有效科学依据，也同时为黄秋葵多糖分子大小和药理作用的相关性研究打下了一定实验基础。1 实验部分1.1 仪器与试药Waters 515型高效液相凝胶色谱仪，Waters 2410示差折光检测器，TOSOH TSKgel-G4000PWXL (7.8 X 300 mm,made in Japan)凝胶色谱柱，Waters公司提供M32 GPC专用软件。DZF一602型真空干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司生产)；WFJ7200型可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司生产；LD52A型离心机(北京医用离心机厂生产)； CARY100紫外扫描分光光度计(美国瓦里安公司生产)；SHB一111循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司生产)；R一200旋转蒸发仪(Buehi公司生产)；VCXSO0超声波破碎仪(美国Sonics&Materials公司生产)。供分子量测定用葡聚糖分子量标准对照品(美国Sigama公司提供，分子量依次为10500、43500、41500、76900、193000、2000000)，蓝色葡聚糖(D2ooo)和葡萄糖由中检所提供；其余试剂均为分析纯；高纯水用Millipore-Q超纯水系统制得；试验用样品黄秋葵多糖自制。1.2 方法与结果1.2.1 色谱条件色谱柱为TOSOH TSKgel-G4000PWXL (7.8 X 300 mm, made in Japan)，流动相为0.3M 硝酸钠溶液(内含0.02M 叠氮化钠)，柱温：40，示差折光检测器(检测器温度40)，流速0.80 mlmin-1，取供试品溶液及对照品溶液各50L注人凝胶色谱仪。1.2.2 材料的制备1.2.2.1黄秋葵多糖的提取与精制 采用黄秋葵(浙江三门富达果蔬专业合作社提供)，取花后6 d的嫩果，80烘干，粉碎后过40目筛备用。取干粉20 g，加蒸馏水300 mL，90提取3 h，抽滤，滤液减压浓缩至100 mL，Savage法(提取液：氯仿：正丁醇=20：4：1，体积比)除蛋白至无明显蛋白层为止11，上清液用95乙醇沉淀，加乙醇浓度到80 。静止过夜后离心(4000 rmin、10 min)，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，真空干燥(45、0.095 MPa)至恒重，得精制黄秋葵多糖。1.2.2.2 溶液制备取实验室自制黄秋葵多糖适量，加去离子水制成每1ml中约含10mg的溶液，振摇，室温放置过夜，作为供试品溶液。另取5个已知分子量的葡聚糖对照品，蓝色葡聚糖(D2ooo)以及葡萄糖对照品，同法制成每lml中各约含10 mg的溶液作为对照品溶液。1.2.2.3 系统适应性试验 取葡萄糖对照品溶液，按1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，按葡萄糖峰计算理论塔板数n=5.54tR/w1/2=16083；另取葡聚糖对照品溶液，按1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，计算分配系数KdKd=(tR-t0)/(tr-t0)=0.52Kd在01之间，符合中国药典2008年版的要求。式中tR为供试品峰保留时间，t0为蓝色葡聚糖(D2000)峰保留时间，tr为葡萄糖 (Do)峰保留时间。1.2.3 标准曲线的制备及样品测定取上述5个葡聚糖系列对照品溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，由GPC专用软件绘制标准曲线，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间的对数值为横坐标进行线性回归，得回归方程。该方法的标准校正曲线线性良好，相关系数达0.9993。根据GPC专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间采用GPC专用软件计算样品各组分的重均分子量及其分子量分布。 表1 葡聚糖分子量标准对照品保留时间对数值及其相应的对数值 分子量 项目 10500 43500 76900 193000 2000000保留时间（min） 14.883 12.521 11.894 10.85 8.433lgM 4.021 4.638 4.886 5.286 6.3011.2.4 精密度试验取供试品溶液50L，按“1.2.1”项下色谱条件，连续测定5次，根据GPC曲线计算重均分子量(Mw )分别为32020，32100，32080 ,32065, 32100 ，RSD 为 0.21% ，表明该系统测定样品分子量的精密度良好。1.2.5 重复性试验取批号为20130627的样品，按“1.2.2”项下方法分别制备供试品溶液5份，按“1.2.1”项下色谱条件测定分子量及其分子量分布，根据GPC曲线计算重均分子量(M )分别为32020，32228，32644，32554，32400，RSD为0.30，明该分析方法测定样品分子量精密度良好。 图1 黄秋葵多糖的凝胶色谱图1.2.6 稳定性试验取同一供试品(批号为20130607)溶液，按“1.2.1”项下色谱条件，在0h、2h、4h、8h、12h和24h分别进样，测定分子量及分子量分布，根据GPC曲线计算重均分子量(Mw)分别为 33255, 33454, 33500, 33656, 33358, 33452 ，RSD为 0.75%在24小时内稳定。1.2.7 样品的测定取不同批号的黄秋葵多糖样品，按 “1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，然后按“1.2.1”项下的色谱条件测定分子量及分子量分布，结果见表2。表2 3批样品重均分子量及其分布情况表批号 Mw Mn Mp PDI 重均分子量 数均分子量 峰值分子量 分子量分布20130530 34038 23151 28544 1.4720130607 33561 23408 28917 1.4320130627 32045 23086 29056 1.382 结果与讨论 植物多糖具有多种生理活性功能，常见蔬菜中多糖研究很少，难以参考，虽然黄秋葵中多糖含量约为2左右，无法与绿茶(多糖4.176.35%)，黄芪(多糖6.55)及枸杞、食用菌多糖相比，但黄秋葵为生长期短的蔬菜，产量大，国外有关于黄秋葵粘多糖流变学及在食品中应用的报道12，其生理活性值得进一步研究。多糖为单糖的天然聚合物，多糖的性质和药理作用与其分子量大小，分子量分布及其结构密切相关13。在众多文献中报道，多糖测定大多采用苯酚-硫酸法14。本文研究引进的凝胶渗透色谱法跟传统的苯酚-硫酸法在研究多糖上具有明显的优势：苯酚-硫酸法仅能测得植多糖的相对于葡萄糖换算得到的多糖含量，正确率大致为90%；而凝胶渗透色谱法能用统计学方法得到多糖的相对分子量，分散度PDI(重均分子量跟数均分子量的比值)的引进更能直观的解释多糖作为聚合物的相对分子量分布情况，如PDI数值较大表明聚合物的分子量分布较大，分子量的均一性不好，大小分子量数值差距大，聚合物需要更进一步精制，PDI数值较小则相反，聚合物均一性好。凝胶渗透色谱法比起苯酚-硫酸法单纯测得多糖含量更有科学应用价值。根据实验测定结果可见，测定的三批黄秋葵多糖的重均分子量分布在3250034500之间，分布宽度PDI均小于2.0，表明黄秋葵多糖提取物均一性良好，分布较窄，不需要进一步优化精制。3 结论用本方法测定黄秋葵多糖的分子量与分子量分布，准确可行，简便快捷，精密度好。分散度的引入，更使黄秋葵多糖的分子量分布更具可控性，能够通过检测该指标反映生产该样品的工艺的变化以及样品质量变化。参考文献（References）1Katsutoshi H，Keiichiro E and Koji H. 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