抗体选择原则-副本.docx

抗体的选择：在选择上一般建议实验种属和抗体种属亲缘性越远越好，不宜同源。二、一抗、二抗的选择原理及方法 1. 一抗选择要点（从兔血清里制备的叫兔源多克隆抗体）（1）确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。（2）确定你的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，还是FACS。一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明 书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证，请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的 抗体。（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，还是Rat。一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验，请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。（4）样本蛋白的结构性质。了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。（5）单多克隆抗体的选择。市面上的抗体还是以多克隆抗体为主，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。2. 二抗选择要点（1）种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。（2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应，而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。只是生产商在检测时使用了不同的种属不同的样品类型，或是参照了不同的文献，对使用者来说，同样的样品，不管使用哪个品牌的，只要抗体是对的，目的条带只会出现在相同的位置。关于分子量的问题，一般不建议看产品说明，WB中条带的位置由样品决定，并不会因为抗体不同而不同。所以在检测蛋白之前，我们可以通过数据库或参考文献，对将要检测的蛋白做个比较全面的了解，包括其可能剪切与修饰的情况、表型的情况等。在第一次使用一个新的抗体时，不要根据分子量横向剪膜，可以保留几个全泳道，看看条带位置或分布的情况。抗体的保存：抗体无论是保存还是运输都应尽可能地避免反复冻融，收到抗体后请根据实验的需要，对抗体进行分装，避免同一管抗体反复冻融（反复冻融会导致抗体空间结构变 性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力）。抗体保存得当与否，直接决定了抗体的活性和使用效果，如果抗体保存得当，抗体活性大部分都可以维持数年。 请谨记，无论何时请按照说明书推荐的保存条件正确处理和保存抗体。（1）收到抗体后，请务必在4，12000rpm，离心3分钟，（无论是液体还是冻干粉状态），再打开管盖进行分装和保存（如果抗体体积小于50ul，请延长 离心时间至5分钟，以保证全部抗体均离心下来）。抗体一般使用特制的储存管，只有在12000rpm离心3分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下 来（即使是在10000rpm离心也会离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象）。（2）对于大部分抗体，比较合适的保存方式是，分装后保存在-20或者-80。5）抗体工作液应该当天配制当天用完，4保存尽量不要超过1天。6）绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中，将抗体保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。（3）大部分抗体收到后4短暂保存12周对抗体活性没有影响。（4）大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要12周的时间，所以是在低温4的条件下来完成的。4运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程），所以运输过程中绝对避免干冰运输。抗冻剂：甘油和乙二醇 冰晶的形成能够破坏蛋白质的结构，因此导致抗体失效。甘油或乙二醇等防冻剂可以防止水分子之间氢键的形成，加入到溶液中可以降低其的凝点。注意： 乙二醇是有毒性的，使用的时候一定要注意安全。 当储存温度低于抗体溶液真实的凝点的时候，抗体溶液就会凝固。但是，这个时候并不会形成冰晶，而是发生了玻璃化作用，其可以保持抗体结果完整性。 为了增加抗体的稳定性，可以向抗体中加入终浓度为50的甘油或乙二醇储存于-20。通常为了避免反复冻融，可以分装抗体。因为普通甘油中含有微生物污染，所以使用无菌的甘油显得尤为重要。 灭菌和杀菌剂 抗体制剂应通过使用0.45微米的过滤器过滤和消毒的，并且其必须进行无菌处理，以防止微生物污染。所以储存这类抗体和制剂的时候加入蛋白酶抑制剂尤为重要。冷藏和/或加入蛋白酶抑制剂可用于防止这种降解。 抗体浓度 抗体浓度过低（1毫克/毫升）更容易发生抗体的失活以及增加物理吸附造成的损失。因此，我们都要尽量的保持抗体在储存期间的高浓度，例如，1-5毫克/毫升。通常的做法是添加“载体”蛋白质，如纯化牛血清白蛋白（BSA）以防止这种降解和损失。多克隆抗体单克隆抗体 单克隆抗体可以保存在50的甘油存放于-20。也可以将其保存在饱和硫酸铵于4或-20保存。多年未见有失活、细菌滋生以及氧化。而冻干法（冷冻干燥，干燥或从冰冻状态）为一些冰冻以后不稳定抗体提供了一种替代的保存方法。在大多数情况下，冻干的抗体最好是存放在-20。虽然冷冻干燥有许多优点，它需要昂贵的设备和劳动力。带标记的抗体带标记的抗体一般储存在黑色容器中或者用锡箔纸盖住。 酶标记抗体碱性磷酸酶和其他酶结合物对于冷冻特别敏感，一般应在4C短期存储。标记抗体