发酵工程试验指导.doc

实验 1 KLa的测定方法氧是难溶气体，在25和1个大气压下，纯水中溶解度为0.25 mol/m3左右。在好氧发酵过程中，氧气由气相传递到液相，为微生物消耗。氧的传递过程限速阻力位液膜阶段，此时Kla是描述氧的传递性能的重要参数。1.目的掌握利用亚硫酸盐测定容积氧体积传递系数的方法，了解氧传递在好氧发酵过程中的重要作用。2原理以Cu离子为催化剂，溶解于水中的O2能立即将水中的SO32-氧化为SO42-，其氧化反应的速度几乎与SO32-浓度无关。实际上是O2一经溶入液相，立即就被还原掉。这种反应特性使溶氧速率成为控制氧化反应的因素。其反应式如下：Cu2+2Na2SO3+O2 2Na2SO4剩余的Na2SO3与过量的碘作用Na2SO3 + I2 + H2O Na2SO4 + 2HI剩余的I2用标准Na2S2O3溶液滴定。I2+ 2Na2S2O3 Na2S4O6+2NaIO2 Na2SO3 I2 Na2S2O31 2 2 4可见，每溶解1mol O2，将消耗2mol Na2SO3，将少消耗2mol I2，将多消耗4mol Na2S2O3。因此可根据两次取样滴定消耗Na2S2O3的摩尔数之差，计算体积溶氧速率。公式如下：式中 NV：两次取样滴定消耗Na2S2O3体积之差，M：Na2S2O3浓度，t：两次取样时间间隔，hV0：取样分析液体积。 将上述NV值代入公式即可计算出kLa 由于溶液中SO3-2在Cu2+催化下瞬即把溶解氧还原掉，所以在搅拌作用充分的条件下整个实验过程中溶液中的溶氧浓度C=0。 在0.1Mpa(1atm)下，25C时空气中氧的分压为0.021MPa，根据亨利定律，可计算出C*=0.24mmol/L，但由于亚硫酸盐的存在，C*的实际值低于0.24mmol/L，因此一般规定C*=0.21mmol/L。所以kLa=NV/0.21 亚硫酸钠氧化法的优点是不需专用的仪器，适用于摇瓶及小型试验设备中kLa的测定。缺点是：测定的是亚硫酸钠溶液的体积溶氧系数kLa，而不是真实的发酵液中的kLa。 3. 试剂 a. 0.1mol/LNa2S2O3溶液（需要标定），在使用前1-2周配置 b.淀粉溶液：称取1g淀粉，放入100mL的水中加热搅拌煮沸2-3min.c.0.05mol/L的I2溶液：称取30gKI，加入10mL,溶解，再称取19.5g碘搅拌充分溶解，定容1.5L（根据实验用量调节），避光保存。d. 0.1mol/L硫酸铜溶液4. 仪器吸管，50mL三角瓶、酸式滴定管、300-500mL三角瓶。5. 实验步骤及方法测定Kla的反应装置，加入适当浓度，如x mol/L（0.050.45mol/L）Na2SO3溶液，每升Na2SO3溶液加入1 ml 0.1mol/L硫酸铜溶液.。在通风搅拌后开始计时（准确秒表）及间隔准确时间取样时，取样量略少于2.5/x,以便于取样为准。取样时注意，迅速取样10ml Na2SO3溶液加入0.05mol/L的I2溶液25ml溶液中。吸管一定要尽可能的靠近碘液液面。然后用标准的0.1mol/LNa2S2O3溶液进行滴定。6. 实验记录及报告反应液组成 Na2SO3： mol/L实验条件反应器名称及规格反应液体积反应温度转速、绝对气压两次取样间隔t/s两次滴定Na2S2O3溶液体积差Kla（1/h）Kla（1/h）平均值思考题1.实际发酵过程中能否用此法进行测定容积氧传递系数？2. 对于几十立方的发酵罐该法是否可行？3. 为什么要吸管一定要尽可能的靠近碘液液面实验2 菌体生长动力学参数的求取（第一部分）目的和要求掌握DNS法测定还原糖和多糖的方法，绘制出标准曲线。一. 原理3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此，可利用分光光度计进行比色测定，求得样品的含糖量。材料与试剂a) 材料：葡萄糖（分析纯）、蒸馏水b) 试剂：DNS液1）以称取3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）6.3 g，氢氧化钠 21.0 g充分溶解于500 ml蒸馏水中（水先煮沸10分钟后冷却） （2）加入酒石酸钾钠（C4H4O6KNa4H2O）182.0g，苯酚（在50水中融化） 5.0g，偏重亚硫酸钠（NaS2O5）5.0g，搅拌至全溶，定容至1000 ml。 （3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置10天后便可使用。平时盛一小瓶放在外面使用，其它储于冰箱中。此溶液每月配制一次。c) 器材：容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、记号笔、电炉、搪瓷缸二. 操作方法a) 标准曲线的制作管号012345葡萄糖标准液(mL)00.20.40.40.81.0蒸馏水(mL)21.81.61.41.21.0DNS试剂(mL) 1.5沸水浴(min) 5冷却 流水冷却蒸馏水(mL) 21.5A540三. 结果1. 以吸光度为横坐标，葡萄糖质量为纵坐标作图。并借助计算机计算出相关系数和曲线方程。 动力学参数求取（第二部分）自20世纪40年代至今，微生物生理学者和生物化学工程学者提出了许多关于微生物生长的动力学模型。这些生长模型根据Tsuchiya理论可分为 （1）确定论的非结构模型，是一种理想状况，不考虑细胞内部结构，每个细胞之间无差别。 （2）确定论的结构模型，每个细胞之间无差别，细胞内部有多个组分存在。 （3）概率论的非结构模型，不考虑细胞内部结构，每个细胞之间有差别。 （4）概率论的结构模型，考虑细胞内部结构，每个细胞之间有差别。 从工程角度看，理想的微生物生长模型应具备下列4个条件： （1）要明确建立模型的目的。 （2）明确地给出建立模型的假定条件，这样才能明确模型的适用范围。 （3）希望所含有的参数，能够通过实验逐个确定。 （4）模型应尽可能简单。目前，常使用确定论的非结构模型是Monod方程。莫诺方程（Monod方程），式中： ：生长比速(h-1)max：最大生长比速(h-1)S: 单一限制性基质浓度(mol/L)KS: 微生物对基质的半饱和常数(mol/L)Sm0.5mKSScrit根据细胞生长动力学，细菌生长速率可以表示为根据细胞生长动力学，细菌的生长速率可以表示为因此在短时间内上式可表示为以 作图，为一直线则符合monod方程，通过斜率和截距可求取动力参数Ks与rmax.二、方法步骤1.培养基配置：葡萄糖 30g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g， 水 1000ml；分装值500ml三角瓶中装瓶量为200mL,0.1Mpa蒸汽灭菌25min.2. 待培养基降至室温，无菌接入种子10mL,放置于37恒温摇床振荡培养；3.按照以下方法取样进行测定时间t发酵液中葡萄糖浓度S菌体吸光度OD600nm8h9h10h11h12h注意：葡萄糖浓度较高稀释后，（具体稀释倍数以吸光度测定值在020.8之间为准）测定的吸光度乘以稀释倍数根据标准曲线进行换算为浓度。同样当菌体浓度吸光度大于1时，要适当稀释（具体稀释倍数以吸光度测定值在020.8之间为准）测定的吸光度乘以稀释倍数。三数据分析序号tXX11(S8h+ S9h)/2(8h时的OD600nm9h时的OD600nm)9h时的OD600nm-8h时的OD600nm（9h时的OD600nm+8h时的OD600nm）/2求取方法见上例如234以作图，符合monod方程，通过斜率和截距可求取动力参数Ks与rmax.五、实验分析六、总结实验3 发酵罐的构造和操作原理 目的要求了解生物发酵罐的基本结构和操作方法实验原理发酵罐是最常见和常用的生物反应器，已经实现生物发酵各种工艺参数的在位测定和自动控制。内容发酵罐基本结构与操作方法。发酵罐的基本结构：生物发酵罐系统=罐体系统+控制机箱+空气压缩机+蒸汽发生器操作流程：开机空罐灭菌加入培养液实罐灭菌冷却接种工艺参数设定运行：发酵+通气终点：放料清洗关机。1. 罐体系统罐身：由硼硅玻璃和不锈钢（316L）加工而成。密封件：机械密封、硅橡胶“O”型圈。罐盖：排气冷凝器口、pH电极口、取样放料孔、取样回气孔、液位电极口、接种口、温度电极口、DO电极口、接地线插口、进气孔、单孔补料孔、三口补料孔、泡沫电极口。2. 管阀系统 管阀系统由EW冷却水电磁阀、W1一溢流水阀、W2一排水排汽阀、S一进蒸汽调节阀、G气路调节阀、不锈钢管路、优质胶管、接头等组成。3.pH电极的校止 进入pH电极校止后，显示界面如下图所示。pH：*.* CALIBTEMP：*C AUTOSLOPE：*.* +/-ZERO：* +/- 校正时，温度补偿是自动的，校正温度应选择于发酵液工作温度附近。操作人员须将随机提供的温度电极和pH电极一同插入中性标准溶液，如pH=6.86，通过面板调整零位ZERO，(用箭头键移动光标到ZERO行的+/-上，按ENTER键即可)使屏幕上pH指示值接近6.86，再将pH计和温度电极一起插入标准的酸性或碱性溶液，如pH=4.0。调整斜率SLOPE(用箭头键移动光标到SLOPE行的+/-上，按ENTER键即可)使pH指示接近4，再重复上述过程1-2次，使pH指示达到标准溶液的pH值即可。斜率SLOPE的变化范围：0.39-1.89，零位ZERO的变化范围122-143，校正完毕用ESC键退出。 实罐灭菌后及发酵过程中应对pH电极进行在线校正。从罐内取出样品后，即用标准pH计检测样品的pH值，再进入CALIB程序，调整零位ZERO，使液晶显示器显示的pH值与标准pH计显示值相同。显然，你应保证这标准pH计是正确的。4. DO2电极的校正进入DO2电极校正后，显示界面如下图所示。DO2：*% CALIBTEMP：*C AUTOSLOPE：*.* +/-ZERO：* +/-校正时，温度补偿是自动的，校正温度应选择在发酵：工作温度附近。操作员将溶氧电极放入些遮酸钠趣盘遥遮，调整零位ZERO，使DO2指示接近于0%，最好为1%-2%，再将溶氧电极取出，以空气作为100%溶氧量来标定，调楚斜率SLOPE使DO2达到100%，再重复上述过程12次即可。SLOPE的调整范围：0.52.0，ZERO的调整范围：125。校正完毕用ESC键退出。实罐灭菌后，在接种发酵刚开始，应对DO2电极进行在线校正，进入CALIB程序，调整斜率SLOPE，使液晶显示器显示的DO2值达到100%。5. 实罐灭菌 第一步 装上已校正好的pH、DO电极 第二步 按工艺要求在罐内放入发酵培养液。 第三步 夹套加热，开启搅拌，待温度上升至90左右，停止夹套加热，关闭搅拌； 第四步 空气过滤器、取样口通入蒸汽加热。当灭菌接近15min左右结束时，关闭空气过滤器蒸汽，打开空气过滤器排污阀，启动空气压缩机，通入空气过滤器。 第五步 控制蒸汽阀门和尾气阀门大小稳定罐体蒸汽压在0.1MPa至灭菌结束； 第六步 打开冷却水关闭排污阀，启动搅拌，降温 。 6 接种采用火焰接种法7. 发酵控制参数设定，进入发酵，定时取样分析，并控制。发酵结束，放罐，拔出电极并加以保护，清洗发酵罐，灭菌。报告1.绘画生物发酵罐的详细结构。2.说明生物发酵罐的操作方法。3.说明生物发酵罐操作的注意事项。实验4 枯草芽孢杆菌生长条件优化在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。实验设计方法发展至今可供人们根据实验需要来选择的余地也很大。目前最常用的方法有,单因素法（One at a time）、正交实验设计（Orthogonal design）、均匀设计 (Uniform design)、全因子实验设计(Full factorial design)、部分因子设计(fractional factorial design)、 Plackett-Burman设计（Plackett-Burman design）中心组合设计（Central composite design）、 BoxBehnken设计(BoxBehnken design)、响应曲面分析法、改进单纯形优化法(Modified simplex method)、遗传算法(Genetic algorithm，GA)等。正交设计法（4学时）目的要求掌握发酵工艺条件或参数的多因素实验设计和操作方法。实验原理发酵过程涉及到数个工艺参数，每个参数有多个水平，每个因素之间还存在交互作用。采用正交试验设计方法进行多因素、多水平的试验，可以大大减少实验，并确定各因素之间的交互作用。实验次数可以减少为：水平数的平方次。在多因素试验中，随着实验因素的增多，处理数据呈几何级数增长。例如，2个因素各取3个水平的试验（简称32试验），有32=9个处理，3因素各取3个水平的试验（简称33验），有33=27个处理，4因素各取3个水平的试验（简称34验），有34=81个处理处理数太多，试验规模变大，会给试验带来许多困难。采用正交试验设计，可以大大减少试验次数。正交试验设计是利用一套规格化的表格正交表来安排试验，适用于多因素、多水平、试验误差大、周期长等的试验，是效率较高的一种试验设计方法。教学内容分组进行多个因素多个水平的多因素试验，测定实验结果。根据实验设备条件，本实验为4因素3水平实验，正交实验次数为9次，采用L9（34）正交设计表。表1 试验因素水平设计表序号试验因素/剂量水平1水平2水平31接种量/%15102装瓶体积/mL/瓶25501503pH67