2017南宁科学技术进步奖推荐书.doc

2017年度南宁市科学技术进步奖推荐书一、 项目基本情况 专业评审组：轻工化工项目名称工业酶制剂性能改良及其高效制备的技术创新与产业化应用是否属于保密项目(B )A、是B、否主要完成单位南宁邦尔克生物技术有限责任公司、南宁中诺生物工程有限责任公司、广西科学院主要完成人韦旭钦、李晓明、韦 航、梁树华、蒙健宗、李 丛、廖东庆、陆 迪、王青艳、林海鹏、韦函忠、卢运琨项目起止时间2013年 1 月 1日起 2016 年 12月30 日止所 属 国 民经 济 行 业科学研究、技术服务项目曾获科技计划、基金资助情况计划、基金名称编 号下达部门下达年度利用整合型重组枯草芽孢杆菌高效生产普鲁兰酶广西科学研究与技术开发计划1348004-2广西科学技术厅2013普鲁兰酶的分子改造及在枯草芽孢杆菌中的高效表达南宁市科技型中小企业创新基金20146371南宁市科学技术局2014利用枯草芽孢杆菌整合系统重组生产多种工业酶制剂南宁科技开发计划20141013南宁市科学技术局2014奖励类别（A）A、技术开发类 B、推广应用类 C、重大工程类 D、社会公益类学科分类名称（代码）生物化学制品（5306250）食品发酵与酿制技术（5502040）授权发明专利（项）5授权的其他知识产权（项）0 南宁市科学技术奖励委员会办公室制二、项目简介一. 科学技术领域：轻工化工、生物催化技术与产品领域二. 简要背景：生物催化技术的本质是以生物酶制剂为催化剂进行物质转化，大规模制备人类所需的化学、医药、食品、能源和新材料等轻化工产品，是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。酶制剂是生物催化的核心关键问题，生物催化工业首要解决的问题是获得大量的性能优良的工业酶制剂。本项目研究在食品、淀粉以及能源等行业工业酶制剂关键问题，运用先进的半理性设计技术，对多种工业酶制剂进行性能改良，并利用枯草芽孢杆菌整合表达系统来高效生产制备这些工业酶制剂，突破我国高效制备性能优良工业酶制剂技术瓶颈，满足我国轻化工领域对优质大量普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶、海藻糖合成酶、-乙酰乳酸脱羧酶和-淀粉酶迫切需求，促进我国生物深加工的跨越式发展。三. 主要技术内容及创新要点1. 主要技术内容（1）酶分子改造半理性设计新策略与技术；（2）枯草芽孢杆菌整合表达新技术；（3）染色体同一位点多拷贝基因整合表达新技术；（4）信号肽分子改良饱和突变技术；（5）半理性设计对普鲁兰酶、-淀粉酶、海藻糖合成酶性能改良和整合高效生产技术；（6）-乙酰乳酸脱羧酶基因多拷贝整合高效表达方法。2. 创新要点（1）开发和建立工业酶分子半理性设计新策略和技术；（2）开发出枯草芽孢杆菌整合表达新技术；（3）开发出同一位点多拷贝基因整合表达新技术；（4）开发出信号肽N端氨基酸饱和突变技术；（5）开发出新型高效普鲁兰酶（PulB-d99-D436H）；（6）开发出制备麦芽糖淀粉酶芽孢杆菌新菌株；（7）开发出海藻糖合成酶新酶融合体；（8）研发出-乙酰乳酸脱羧酶等酶的多拷贝整合表达枯草芽孢杆菌新菌株；（9）开发出耐热、耐酸性新型-淀粉酶新突变体。四. 技术经济指标项目完成a-乙酰乳酸脱羧酶、海藻糖合成酶、普鲁兰酶和-淀粉酶多个酶制剂的研发及实施产业化，经济效益明显，项目2014年以来累计实现新产品产值5417.51万元，销售6344.39万元；实现利润767.59万元，税收430.37万元，出口创汇422.5万美元，节约能源及原（辅）材料593.6万元。其中南宁邦尔克生物技术有限责任公司生产新型a-乙酰乳酸脱羧酶达到63吨产值1889万元，生产普鲁兰酶91吨产值907.81万元；南宁中诺生物工程有限责任公司生产食品及高纯度海藻糖296吨产值2306.2万元。项目申请发明专利9项，已获得发明专利授权5项，发表论文3篇。五. 促进行业科技进步作用及推广应用、效益情况本项目技术创新及其产业化应用，带来明显的经济效益和社会效益，促进我国啤酒工业和淀粉深加工以及淀粉糖、麦芽糖和麦芽糖醇工业的发展，摆脱对进口酶制剂的依赖，具有重要的战略意义；研发的酶制剂广泛推广应用到淀粉深加工行业中，进一步提高淀粉的附加值，增加淀粉及其衍生物的品质和应用范围,在生产过程中减少环境污染,具有显著的生态效益。本研究建立一套食品安全的枯草芽孢杆菌整合型高效分泌表达系统，对我国食品加工用酶制剂的安全生产起到了示范作用，对保证食品加工过程的安全具有示范意义。项目产品已经在全国18家大、中型啤酒制造企业和3家淀粉糖制造企业推广应用，出口到英国、德国、越南、印度、波兰、比利时等6个国家。本项目2014-2016年，推广应用企业实现产值17.36亿元，新增利润7528万元、税收6038万元，出口创汇424万美元，累计节支9912万元。国内相关行业受益超过6.5亿元。三、项目主要科技创新阐述项目具有创造性的关键技术或成果转化和推广应用的集成创新与推广模式创新内容。项目具有创造性的关键技术：（1） 酶分子改造半理性设计新策略与新技术酶的催化反应一般经过底物结合（E+S）、催化反应（ES）以及产物释放（P+E）三个过程，通过结构比对同类酶底物输送通道（I）、催化反应区域（II）以及产物释放通道（III）相关位点氨基酸的差异（如下图），准确、快速地预测突变的关键位点（即下图的A、B、C、D、E、F、G的突变位点，即半理性设计）。实验证明，这种半理性设计的新策略和技术能有效地把酶的有效突变点限制在小范围内（而不是大海捞针），从而有的放矢，能快速、有效地改良酶的特性。本项目独创性研发和运用先进的半理性设计策略与技术分别对普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶、海藻糖合成酶、-乙酰乳酸脱羧酶和淀粉酶分别进行结构模拟（同源建模）和三维结构分析、活性中心和功能位点的预测和分析等半理性设计，再以的理论模拟结果为依据进行有针对的改良，奠定了工业酶分子改良的理论基础，有效地解决了科研实践中的盲目性和不可遇见性，大大地节约时间和科研资源。该半理性设计新策略与新技术对本项目相关工业酶的性能改良皆取得可喜成果，不同种类酶优良突变体的获得详见下文相关内容。以普鲁兰酶理性设计为研究对象，其理性设计策略、方法和技术成果发表在核心刊物上（ “长野芽孢杆菌普鲁兰酶的同源建模及其三维结构分析”，生物信息学，2017，15（1）：27-32.）。（2） 枯草芽孢杆菌整合表达技术及基因多拷贝整合高效表达新技术枯草芽孢杆菌整合表达系统是当前较为先进的蛋白表达系统，本研究通过整合表达质粒pMLK-83，将外源基因连同启动子插入在质粒两段与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源序列之间，在同源重组过程中，通过同源双交换法，这两段序列与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因序列发生双交换，一方面把质粒上的两段同源序列的基因整合到芽孢杆菌染色体上，另一方面使枯草芽孢杆菌淀粉酶基因失活，从而更容易筛选出转化子。通过同源双交换法将外源基因整合到芽孢杆菌染色体上，整合的外源基因随受体染色体DNA的复制而复制，重组菌在没有抗生素选择压力下可以连续传代培养而不丢失基因表达盒，有效地解决了外源基因遗传不稳定、表达不稳定的问题，同时解决了基因工程菌在生产过程中滥加抗生素的问题，明显减少生产成本，彻底消除抗生素残留和抗性基因在环境中的扩散，这对生产食品和药品用蛋白质产品十分有意义。枯草芽孢杆菌整合表达系统的研制成功，为高效整合表达工业酶制剂奠定了技术基础。单个基因的整合表达，可以满足一般酶制剂的生产要求。但对于表达量低，表达基因的拷贝数低时，直接影响外源蛋白的总表达量。本企业研发人员利用丰富的经验，独创性开发多基因整合技术，即利用整合质粒的抗性基因替换的方法结合筛选标记筛选出重组菌，再用替换抗性基因筛选标记的质粒替换抗性基因筛选标记，经过若干轮整合-替换-再整合，可以获得两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组同一位点的重组菌。通过同源重组办法将编码工业酶制剂的基因多个拷贝整合到芽孢杆菌染色体上，从而明显提高酶的合成效率和合成总量。其操作步骤首先是将外源基因表达单元克隆到含抗性基因筛选标记A的整合质粒，利用整合质粒将外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体获得重组菌1，然后利用替换抗性基因筛选标记的质粒将重组菌1中的抗性基因筛选标记A 替换为另一抗性基因筛选标记B，得到重组菌2。整合质粒再转化重组菌2，通过抗性基因筛选标记A 和B进行筛选得到包含两个外源基因表达单元的重组菌。重复替换抗性基因和整合，可以获得两个以上相同或不同的外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体的同一位点，有效保证了多个外源基因的遗传稳定性和表达稳定性。基因多拷贝整合表达技术研制成功，从根本上解决了单基因表达拷贝数低、酶总产量低的问题。枯草芽孢杆菌整合表达技术及基因多拷贝整合新技术成果即 “一种能用同源重组来克隆的枯草芽孢杆菌整合载体的构建及其应用”、“将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法”都获得中国专利，并发表论文1篇即“利用抗性基因替换的方法将两个拷贝外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组同一位点. 基因组学与应用生物学，2014（33）3，570577”。（3）信号肽分子改良的饱和突变技术信号肽对于蛋白的分泌表达起到关键作用，其N端序列影响酶表达和分泌水平。通过对枯草芽孢Sec分泌途径的-乙酰乳酸脱羧酶基因的信号肽之N端序列进行分析模拟、饱和突变和筛选，发现将信号肽N端序列第7位苏氨酸替换为缬氨酸时，酶胞外表达量明显提高，即得到新突变体WB600p43-bnPul-T7V，该突变体用于表达重组普鲁兰酶时，最高发酵胞外酶活力达1420 U/ml，分泌率达88%，活力提高达50%，解决了天然信号肽分泌表达能力较低的问题，该信号肽突变体可用于多个工业酶制剂的表达生产，其独创的技术成果已申报中国专利，即“一种能提高重组普鲁兰酶表达量的信号肽突变体及其应用，中国专利，专利申请号：CN201610125646.1，已实审”。（4）普鲁兰酶的分子改造及在枯草芽孢杆菌高效表达新技术项目构建了枯草芽孢杆菌整合型普鲁兰酶表达系统，新型枯草芽孢杆菌表达系统成功、高效表达了长野芽孢杆菌的普鲁兰酶基因，表达酶活远高于国内水平，并进行了试生产。在此基础上，项目对普鲁兰酶进行半理性设计和分子改造，获得了一个性能优异的突变体PulB-d99-D436H，此突变体更耐酸，在pH 3.8-5.5范围保持80%的活力，在pH为3.5时，酶活水平由原来的20%提高到60%左右；突变酶在5565的酶活基本不变，而亲本酶在65时酶活已经降到10%，突变酶在70的酶活水平由亲本酶的小于1%提高到30%左右；而在37存放时，突变酶则显示出更明显的优势，存放120天后，仍能保持近90%的活力，而亲本酶的活力已经降到接近50%，突变酶的这一优良稳定性，对产品的运输和存放，以及对产品酶在应用中的持久性都具有非常好的影响。 以上结果表明，突变酶良好的耐酸性和热稳定性，更加适合于淀粉糖化过程较高的温度（5565）和微酸性环境（pH 3.85.5）这样的条件，突变酶更适合于工业化应用。经过发酵条件优化，40小时发酵后，枯草芽孢杆菌整合菌株表达普鲁兰酶突变体在生产罐中酶活最高达1294 U/mL，远远高于国内已报道的发酵酶活，国外已报道的最高发酵酶活为813 U/mL， 但发酵时间长达113小时；通过对信号肽的分子改造，进一步提高了普鲁兰酶胞外总表达活力达50%以上，小试发酵实验中，胞外酶活由最高的980 U/mL提高到1400 U/mL以上，分泌率达88%。普鲁兰酶的生产已商业化，生产普鲁兰酶91吨产值907.81万元，生产的产品符合企业标准。此研究成果申请了4篇专利，已获授权1篇，发达论文1篇，即“一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法，中国专利，申请号：201310174694.6，已授权”；“一种普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H的制备方法及其应用，专利申请号：CN201610043739.X”，已实审；“一种外源基因DNA片段克隆到质粒载体相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点的方法，中国专利，申请号：201610219972.9，已实审”；“一种质粒载体的克隆方法及试剂盒，中国专利，申请号：201710030080.9，已实审”；“长野芽孢杆菌普鲁兰酶的同源建模及其三维结构分析”，生物信息学，2017，15（1）：27-32）。（5）麦芽糖淀粉酶和海藻糖合成酶基因的克隆、改造和表达研究在国内首次克隆来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）新的麦芽糖淀粉酶基因，置于不同的启动子和信号肽，整合到枯草芽孢杆菌染色体中，构建成功生产麦芽糖淀粉酶新菌株；在国内首次克隆研究了来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)、弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)、水栖嗜热菌 （Thermus aquaticus)和玫瑰链霉菌的海藻糖合成酶基因，对这些不同来源的酶进行了比较。通过结构分析，对来源于玫瑰链霉菌的海藻糖合成酶基因进行了分子改造，在C 端连接上一段能提高其热稳定的氨基酸序列构建得到新的融合酶突变体，海藻糖合成酶融合酶体的最适反应温度从2025提高到5055，热稳定性也得到提高，催化麦芽糖的产物海藻糖得率为79，比来自嗜热菌Thermus thermophilus 海藻糖合成酶67的海藻糖得率高，这种海藻糖合成酶融合酶突变体更有利降低海藻糖的生产成本。此融合体保持了亲本酶转换率高的优点，同时大幅提高了酶的热稳定性和最适反应温度。我们同时尝试利用在食品应用中安全的枯草芽孢杆菌表达生产海藻糖合成酶，获得了整合表达藻糖合成酶的菌株，而且表达的海藻糖合成酶分泌到胞外，无抗菌活性，达到食品应用酶制剂要求，有利于下一步海藻糖的制造。海藻糖合成酶已经商业化生产且用于海藻糖的制备，生产的海藻糖合成酶符合企业标准。此研究申请了2篇发明专利，均已获得授权，即“以整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法. 中国专利，申请号：201310174692.7，已授权”；“一种耐热海藻糖合成酶融合酶突变体基因及其应用，中国专利，申请号：201310369255.0，授权)”。（6）新型-乙酰乳酸脱羧酶高活力表达技术将-乙酰乳酸脱羧酶基因以多拷贝方式整合到食品安全的宿主枯草芽孢杆菌染色体同一位点，实现了外源基因在芽孢杆菌染色体多拷贝的表达和稳定遗传，从源头上解决了质粒表达需要在发酵过程中保持抗生素压力的问题，不再需要发酵过程添加抗生素和分离纯化过程中去除抗生素，达到终产品中无抗菌活性的要求，完全满足国际市场的质量技术要求；构建的枯草芽孢杆菌整合表达系统发酵产酶量稳定在700-900 U/ml，最高可达900 U/ml；在此基础上，通过优化发酵条件和培养基，进一步提高表达酶活稳定达到1000-1200 U/ml，最高达到1300 U/ml以上，分泌率达95%以上。此研究进一步降低了-乙酰乳酸脱羧酶的生产成本，提高了综合竞争力，并且为其他酶制剂的生产提供了发酵工艺方面的参考及借鉴，新型-乙酰乳酸脱羧酶继续商业化生产，生产的产品符合国家标准。其制备方法“一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产-乙酰乳酸脱羧酶的方法”获得中国专利授权。（7）微生物-淀粉酶分子改造、分泌表达研究及产品开发技术采用半理性设计和计算软件Pre-pKa对热硫梭菌-淀粉酶进行结构分析、理性设计和突变筛选，得到了4个具有应用前景的-淀粉酶突变体，其中突变体4F12和5C1的最适反应温度分别为65和60，适宜的pH分别为4.57.5和4.56.0； 突变体YH2和PSBA-S4的最适pH为4.0，在pH2.54.5和4575条件下稳定性好。在分泌表达方面，项目以枯草芽孢杆菌为表达宿主，实现整合型高效分泌表达热硫梭菌的-淀粉酶，发酵酶活达1839 U/mL, 分泌率93.5%；项目建成年产100吨新型-淀粉酶的生产线，试产产品经法定机构检验，各项指标符合企业标准的要求。其枯草芽孢杆菌整合表达生产技术即“一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达-淀粉酶的方法” 取得中国专利，其耐酸性、耐高温突变体皆取得专利授权，并发表论文1篇，即“一种耐酸性高温-淀粉酶的突变体TBA-H2及其应用. 中国专利，申请号：201410094145.2，已授权”；“一种耐酸性高温-淀粉酶突变体及其应用. 中国专利，申请号：201310730539.8，已授权 ”； “重组Clostridium thermosulfurogenes -淀粉酶的分泌表达.食品科技，2015（7），4044。”五、项目曾获科技奖励情况获奖时间奖 项 名 称奖励等级授奖部门（单位）无六、公开发表的论文专著（不超过20篇）序号论文专著名称/刊名/作者年卷页码（ 年 卷 页）发表时间（ 年 月）通讯作者第一作者1长野芽孢杆菌普鲁兰酶的同源建模及其三维结构分析/生物信息学/韦旭钦、李晓明、廖东庆、黄日波2017年15卷2732页2017年3月韦旭钦韦旭钦2重组Clostridium thermosulfurogenes -淀粉酶的分泌表达/食品科技/梁钰 等2015年第7期404