一种CAST基因过表达小鼠建立.doc

钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb/C小鼠的繁育及鉴定虞 勇，李明辉，刘桂剑，李冰玉，邹云增，陈瑞珍*（复旦大学附属中山医院心血管病研究所实验室，上海 200032）收稿日期2016-02-03 接受日期2016-06-04基金项目国家自然科学基金(31070786). Supported by National Natural Science Foundation of China（31070786）. 作者简介虞 勇，主管技师. E-mail: *通信作者(Corresponding author). Tel:8543, E-mail: 摘要目的：建立Balb/C小鼠遗传背景的钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin, CAST）基因过表达小鼠的培育方法，并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的应用价值。方法：将雄性C57BL/6-CAST+/-转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交，子代小鼠中取雄性鉴定为CAST+/-杂合子小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交，连续杂交直至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织，采用碱性裂解液提取基因组DNA，PCR法扩增CAST基因片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒（CVB3）感染Balb/C-CAST-/-小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果：C57BL/6-CAST+/-转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL/6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能夠满足后续实验需要，且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST-/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论：成功建立Balb/C-CAST基因过表达小鼠，为后续研究奠定了基础；碱性裂解液提取基因组DNA简单、高效，值得推广。关键词钙离子依赖性蛋白酶；钙蛋白酶抑制蛋白；柯萨奇B3病毒；转基因；基因型鉴定中图分类号 R 文献标志码 ABreeding of calpastatin gene overexpression and identification in Balb/C mice YU Yong, LI Ming-hui, LIU Gui-jian, LI Bing-yu, ZOU Yun-zeng, CHEN Rui-zhen*Laboratory of cardiovascular disease research institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China AbstractObjective：To establish methods for the breeding of calpastatin (CAST） gene overexpression mice on Balb/C background and to investigate the application of alkaline lysis solution extracted genomic DNA in genotyping. Methods： Tg-C57BL/6-CAST+/- male mice were backcrossed to Balb/C wild type female mice. In the filial generations, CAST+/- heterozygous male mice were backcrossed to Balb/C wild type female mice for more than 10 generations to remove C57BL/6 genetic background. Then, Balb/C-CAST-/- mice from the same brood were infected with coxsakievirus（CVB3）to establish the mouse model of acute viral myocarditis.Genomic DNA was isolated from filial generation mice tails. Then CAST gene fragment was amplified by PCR. Results：The reproduction of the filial generations with different phenotypes(CAST+/-, CAST-/-) is basically in accordance with Mondels Genetics Law. To remove C57BL/6 genetic background,CAST+/- heterozygous male mice should be backcrossed to Balb/C wild type female mice for at least 10 generations. the Mouse model of VMC with Balb/C-CAST-/- mice was established. The agarose electrophoresis showed that the molecular weight of PCR products were consisted with that of objective gene fragments. Conclusions：Calpastatin gene overexpression transgenic mice on Balb/C background is a comparatively ideal experimental animal to study the interaction between calpain and CAST in the context of viral myocarditis and other diseases.The method of DNA extraction in our study can isolate genomic DNA from large number of tissue samples of mice which providing a solution for genotyping.Key Words calpain；calpastatin；coxsakie virus group B type3（CVB3）; transgenic；genotypingCalpain是一类主要存在于细胞质中的钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶，激活后能通过有限酶切作用切割其底物，参与包括心血管疾病在内的多种病理过程1-2。研究3发现，Calpain在急性病毒性心肌炎（VMC）发病过程中被激活，介导柯萨奇B3病毒（CVB3）直接感染导致的心肌损伤作用。在许多炎症性疾病模型的研究中，calpain抑制剂表现出相应的器官保护作用4。Calpastatin（CAST）是Calpain的内源性抑制剂，在心肌细胞内两者共定位，CAST负向调控Calpain的活性，在体内及体外过表达CAST均可抑制Calpain活性5。转基因动物模型常用于致病机制的探讨及治疗药物的筛选，2011年本研究室从加拿大西安大略大学病理生理学系彭天庆教授实验室引进了C57BL/6-CAST基因过表达小鼠。因此，本研究以C57BL/6-CAST基因过表达小鼠为基础，尝试建立稳定的Balb/C小鼠遗传背景CAST基因过表达模型，为后续研究奠定基础。1 材料与方法1.1 主要材料及试剂 实验动物：C57BL/6-CAST+/-杂合子转基因小鼠雌、雄各1只（56周龄）引进于加拿大西安大略大学病理生理学系彭天庆教授实验室，Balb/C雌性野生型小鼠（56周龄）购于复旦大学实验动物部。试剂：2PCR Master mix、DNA Marker购自Thermo Fisher公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；小鼠cTnI ELISA试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司； CVB3（Nancy株，由本实验室保存复制），在Vero细胞上复制。基因组DNA裂解液配制：溶液A成分为25 mmol/L NaOH，0.2 mmol/L EDTA；溶液B成分为40 mmol/L Tris-HCl，pH值5.0。小鼠组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。仪器：Thermo Fisher公司高速台式冷冻离心机；美国Bio-Rad公司PCR仪、电泳槽、ChemiDoc MP System 全能型成像系统；Eppendorf紫外分光光度计。1.2 Balb/C遗传背景CAST基因过表达小鼠的培育 转基因小鼠饲养于复旦大学实验动物部，光照及黑暗每隔12 h循环，恒温恒湿，自由饮水进食，自然交配。采用1雄配3雌合笼的方法将雄性C57BL/6-CAST+/-小鼠与雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖，F1代子鼠在3周龄时与亲代分离，提取鼠尾DNA，用PCR方法鉴定出CAST基因表达阳性小鼠，将雄性CAST基因表达阳性小鼠与雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖，获得的F2代雄性CAST+/-小鼠继续与雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖，连续交配直至可获得遗传背景稳定的Balb/C- CAST基因过表达小鼠，具体繁殖方案见图1。C57-CAST+/- Balb/CP100%C57BL/60%Balb/CCAST+/-CAST+/-Balb/CF150%C57BL/650%Balb/CCAST+/-N225%C57BL/675%Balb/CCAST+/-Balb/CCAST+/-N100.1%C57BL/699.9%Balb/C图1 Balb/C遗传背景CAST基因过表达小鼠繁育方法此图不清楚，请提供清晰的图片！1.3碱性裂解液提取子代小鼠基因组DNA及PCR鉴定 子代小鼠断奶打耳号标记后剪取12 mm鼠尾，采用碱性裂解液法提取DNA，放入1.5 mL EP管，加入50 L溶液A，于金属浴上95孵育40 min，室温放置1.5 h，再加入50 L溶液B，充分震荡混合，4 10 000g离心5 min，放4冰箱待用。基因组DNA提取试剂盒（北京天根）操作按说明书进行。基因组DNA扩增：CAST基因引物上游，5-GTT GGC TTA GGC TGC TTT TCG T-3；下游，5-CCA GAC TCC GTG ACA CCC CTT-3。目的基因片段长度为518 bp。PCR反应体系：2PCR Master Mix 12.5 L，Primer（25 mol/L）0.4 L，DEPC-H2O 10.1 L，cDNA 2 L，总体积25 L。PCR反应条件：(1)预变性94，3 min；(2)变性94，30 s；(3)退火60,30 s；(4)延伸72，60 s；重复步骤(2)(4)40次循环；(5)最后延伸72，10 min；(6)4保存。琼脂糖凝胶电泳:用0.5TBE缓冲液配置1%琼脂糖凝胶，加热融化，待温度降至60左右加入溴化乙啶（EB）12 L（10 mg/mL），混匀后铺板，室温放置30 min，待凝胶完全凝固后放入电泳槽，25 L PCR样本+5 L 6Loading Buffer，上样量30 L，电压90 V，电泳40 min，使用Bio-Rad凝胶成像仪进行凝胶扫描。Eppendorf紫外分光光度计上检测各样本浓度在600800 ng/mL，D260/280值在1.61.8。1.4 Balb/C-CAST-/-小鼠急性心肌炎模型的建立 以第10代同窝34周龄、基因型鉴定为CAST-/-的雄性小鼠腹腔注射100 TCID50的CVB3 0.1 mL/只，对照组腹腔注射Eagle液0.1 mL/只，正常条件饲养7 d时断颈处死，取心肌组织在10%中性甲醛中固定，H-E染色观察心肌组织病变程度；取小鼠外周血分离血清，ELISA法检测外周血中cTnI含量。1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，数据以xs表示，两样本比较采用t检验，组间显著性检验采用单因数方差分析，所有实验重复3次，检验水准（）=0.05。2 结 果2.1 转基因小鼠大体观察 结果（图2）表明：经过连续10代以上杂交，得到遗传背景稳定的Balb/C-CAST基因过表达小鼠。图2 不同遗传背景CAST基因过表达小鼠A: C57BL/6-CAST基因过表达小鼠;B: 杂交F1代CAST基因过表达小鼠;C: 杂交第10代Balb/C-CAST基因过表达小鼠2.2 碱性裂解液法及商品化试剂盒提取基因组DNA效果的比较 结果（图3）表明：碱性裂解液提取DNA效果与市售DNA提取试剂盒完全符合。图3 杂交第10代Balb/C-CAST小鼠不同基因型PCR鉴定结果15：碱性裂解液法提取DNA；6：DNA marker; 711: 试剂盒提取DNA. 1,7: 同一标本（Balb/C-CAST+/-）补充具体基因型！下同 ；2,8：同一标本（Balb/C-CAST+/-）；3,9：同一标本（Balb/C-CAST-/-）；4,10：同一标本（Balb/C-CAST-/-）；5，11：同一标本（Balb/C-CAST+/-）2.3 Balb/C-CAST-/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型的建立 同窝基因型鉴定为CAST-/-的雄性小鼠感染CVB3进行急性心肌炎造模7 d后，可见心脏表面有点状、片状白斑（图4）。H-E染色（图5）显示：心肌组织可见明显病灶和炎性细胞浸润，心肌纤维排列紊乱，局部存在钙化现象。CVB3模型组小鼠外周血cTnI定量检测，与注射Eagles液对照组小鼠相比，外周血cTnI浓度显著上升（P图6删除，提供原始数据！0.01）。（ng/ml） 1 2 3 4 5 6 平均数 SD P值对 照 组 0.02 0.01 0.65 0.33 0.23 0.16 0.233 0.24CVB3组 8.33 6.52 1.23 3.42 9.25 6.48 5.872 3.03 0.00106图4 VMC造模小鼠心脏外观A: 正常对照小鼠心脏；B: CVB3感染7 d小鼠心脏图5 VMC造模小鼠心肌组织H-E染色AC:正常对照小鼠心肌组织；DF: VMC小鼠心肌组织.Original magnification: 10(A,D); 100(B,E); 400(C,F)3 讨 论Calpain是一类主要存在于胞质中的钙离子依赖性的半胱氨酸蛋白酶，与许多疾病相关6，是许多疾病的潜在分子治疗靶点7-8。前期研究3已证实，Calpain在急性病毒性心肌炎（VMC）发病过程中被激活，介导CVB3直接感染导致的心肌损伤作用。CAST是Calpain的内源性抑制剂，通过其C末端的I、IV结构域结合Calpain抑制其活性，同时通过其特定的氨基酸序列调节Ca2+通道的启闭，调控Calpain活性9。Balb/C小鼠是公认的病毒性心肌炎模型动物，而C57BL/6-CAST基因过表达小鼠因其C57BL/6小鼠遗传背景导致的免疫偏离不适合用作病毒性心肌炎模型小鼠10。因此，需要用C57BL/6-CAST基因过表达小鼠与Balb/C小鼠进行杂交，以去除C57BL/6小鼠遗传背景。一般认为，通过至少10代的回交，同类系基本可以去除C57BL/6小鼠遗传背景，8代及以上的代数种群小鼠，可基本认为遗传背景一致11。本研究以第11代同窝3周龄基因型鉴定为Balb/C-CAST-/-的雄性小鼠感染CVB3制作VMC小鼠模型，CVB3模型组5只小鼠造模均成功，提示该类系小鼠已排除C57BL/6小鼠遗传背景影响，完全可用于VMC小鼠模型制作。本研究采用碱性裂解液裂解法提取DNA，所用试剂均为常规化学试剂，不需用蛋白酶K，DNA得率较高、成本低廉；不使用酚、氯仿等试剂，不污染环境；不需要匀浆操作，避免交叉污染；鉴定结果与市售商品化DNA提取及基因型鉴定试剂盒相比，完全一致。此外，使用碱裂解法提取DNA能节约大量实验经费，尤其是进行大批量小鼠的基因型鉴定时。本研究室自2012年起使用该方法对转基因/基因敲除小鼠进行基因型鉴定，取得了稳定、可靠的鉴定结果，证明其是一种高效、低成本的解决方案，完全能够满足后续实验的需要。综上所述，本研究成功建立Balb/C-CAST基因过表达小鼠，为后续研究奠定了基础；采用的碱性裂解液提取基因组DNA具有高效、可靠、低成本的特点，值得推广。参考文献1Ono Y, Sorimachi H. Calpains:an elaborate proteolytic systemJ. Biochim Biophys Acta, 2012,1824(1):224-236.2Inserte J, Hernando V, Garcia-Dorado D. Contribution of calpains to myocardial ischaemia/reperfusion injuryJ.Cardiovasc Res, 2012, 96(1):23-31.3李明辉,汪云开,虞勇,陈瑞珍,杨英珍.急性病毒性心肌炎小鼠心肌中Calpain mRNA表达与心肌细胞凋亡的关系研究.中国分子心脏病学杂志, 2009, 9(5):277-281此文献没有检索到！请提供原始文献和正确的著录格式，必要时更换文献.4Li X, Li Y, Shan L, et al. Over-expression of calpastatin inhibits calpain activation and attenuates myocardial dysfunction during endotoxaemiaJ. Cardiovasc Res, 2009, 83(1):72-79.5 Campbell RL, Davies PL. Structure-function relationships in calpainsJ. Bioche