溶胶凝胶技术在电化学传感器中应用进展.doc

溶胶凝胶技术在电化学传感器中的应用进展摘 要 本文主要评述了近年来溶胶凝胶技术在电化学传感器中的研究进展，包括在测定酚、葡萄糖类等物质实验方面的介绍，并探究了溶胶一凝胶与血红蛋白有较好的生物兼容性。结合了碳纳米管方面的应用制备了一种性能优良的葡萄糖生物传感器。 关键词 溶胶-凝胶；电化学传感器；葡萄糖；碳纳米管；1 引言溶胶一凝胶技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、凝胶而固化，再经过热处理而制得氧化物或其他化合物固体的方法。近年来，人们发现溶胶一凝胶材料是一类非常适合于固定生物试剂的基质材料1-5 凝胶过程通常在温和的条件下进行，可以很大程度地保持酶等生物物质的功能和活性L6-7利用溶胶一凝胶技术固定各种生物试剂基质材料，制成的生物传感器具有灵敏度高、稳定性好、抗干扰能力强等特点8-11 溶胶凝胶包埋酶的过程中，胶体粒子逐渐聚集形成三维网络结构。一些添加剂聚乙二醇(PEG)，聚乙烯胺(PEI)等覆盖硅胶中，能提高酶的活性。同时也能减少溶胶凝胶的收缩，作为孔径填充物防止孔塌陷。研究中发现将多羟基高分子掺人溶胶中，由于形成互穿网络而显著增大了凝胶的强度，从而防止了干裂。陈化时间对凝胶孑L径大小、交联程度有较大的影响。同时，在不同的介质中陈化时，也会得到不同的凝胶干缩结构，如在酸性介质中，得到的凝胶结构致密，孔径较小，故有利于酶分子的包埋。利用溶胶一凝胶技术固定生物酶制备的生物传感器在测酚、有机溶剂和糖类等物质中有着很好的效果。2 溶胶-凝胶技术固定生物酶制备的生物传感器测定酚、 糖类等物质2.1 测定含饱和苯系物废水中的酚类化合物采用正硅酸乙酯水解制备溶胶一凝胶包埋酶制作溶胶一凝胶电极，以提高电极的灵敏度，增强电极的选择性和抗干扰能力。测定了含饱和苯系物废水中的酚类化合物，。溶胶一凝胶的制备 先将TEOS溶于无水乙醇，加入一定量水，用HC1调节溶液pH 值，然后放人梨形瓶中，恒温下用旋转蒸发仪定速搅拌水解一定时间后，再加入丙三醇继续搅拌，二次水解30 min。电极的制作 将石蜡碳糊填于预处理好的电极杆底部压实，在碳糊电极表面留有一层约1 妈妈深的凹槽，待用。称取01 mg酪氨酸酶(50 000 U17mg)溶解于缓冲溶液(pH：70)中，加入陈化好的溶胶一凝胶搅拌均匀，再用碳粉调成糊状填人上述预留凹槽中并压实，在硫酸纸(放在光滑玻璃板上)上磨光，用渗析膜包好，置于冰箱冷藏室里陈化一天待用。电极使用前先在pH 54的磷酸盐缓冲溶液中浸润。电极不用时于冰箱中4保存。 溶胶一凝胶碳糊电极的制作及参数的优化设计8因素10水平的实验方法，并结合电极的响应灵敏度来确定酶电极制作中各组分最佳加入量，其中以反应完全、水解后呈均匀透明的溶胶、老化后呈粘稠状且均匀透明的凝胶、凝胶不干裂、滴膜光滑透明无裂痕、电极本底值最小及响应值最大作为评价溶胶和电极的标准。实验数据经过统计处理后得到试验范围内的最佳工艺条件为：水和TEOS的摩尔比4：2；乙醇体积为25 ；溶液pH 值15；水解温度20；水解时间3 h；老化温度20；老化时间2 d。电极制作中溶胶-凝胶与缓冲溶液体积比为2：1。 溶胶一凝胶固定酪氨酸酶电极工作条件的确定工作电位的选择 采用制备的生物电极获得的循环伏安图如图1所示。根据所得的实验数据以及一些干扰离子的电位，确定本电极的工作电位为一100 mV。 溶液pH值和测量时间的选择 电极响应与溶液pH值的关系见图2。在pH值约52时电极的响应值最大，考虑到酪氨酸酶的适宜pH范围为6070，所以选择pH 54作为操作条件。由溶胶一凝胶电极的时间响应关系确定，响应时间为3 min，这时电极响应值可达95 以上。电极性能测试检出限、线性范围及电极稳定性检出限根据信噪比SN 3来确定。相应实验数据列于表1。由表1的实验数据可以看出，电极在陈化一天后响应的灵敏度最高，但电极的稳定性不好，检测范围很窄；随着电极的使用，电极的稳定性和检出限都增大。其可能原因为随着电极表面在缓冲溶液中的浸润时间的增加和电极微表面的进化，校正了酶空间构型，使酶的活性中心外漏，易与底物接触，从而提高酶的活性。电极在使用24 h后稳定性和检测范围都增加了，但其响应值有递减的趋势，这可能与溶胶一凝胶对酶活性的影响有关，或者由于电极表面有其它物质(如醌氢醌)覆盖而受到抑制。 精密度和准确度标样和样品浓度分别为1O010 molL和5O010一molL。在工作电位一100 mV，pH 54，响应时间3 min的条件下进行测定，电极在同一底物中6次试验结果的RSD为104 ，标样与样品测定值之间的相对误差为0002 。溶液中酚的测定对溶液中各种酚类进行了测定与比较，其结果列于表2。可以看出，国家标准方法(分光光度法)仅能测定苯酚、邻甲酚、间甲酚，无法测定其它酚类。本法对苯酚、邻甲酚、对氯苯酚、邻苯二酚、间甲酚响应较好。 电极抗干扰能力和对化工废水分析生物酶同含有苯及苯系物的化工废水接触将很快失活，实验采用溶胶一凝胶法在碳糊中固定生物酶制备生物传感器，解决了此问题。用本法对有苯及苯系物的含酚10010一 molL的化工废水进行了分析，结果显示，测定值与参考值之间的相对误差为0007-0053。2.2硅溶胶-凝胶包埋纳米金和酶的葡萄糖生物传感器 参考文献12方法，将置于烘箱里，下放置约，得，完全冷却后用的盐酸溶液调节比重到.，过滤后得到澄清的水玻璃溶液。取出用水（体积比）稀释，再经过磺酸基型阳离子交换柱后，得到.的硅溶胶，备用。酶电极的制备金电极（直径为，实验室自制）用.的细砂纸湿磨电极，.的三氧化二铝粉抛光，随后依次用无水乙醇、亚沸水超声洗涤，最后将电极放在.的硫酸底液中，在.-.的电位范围内，以.的扫描速率进行电化学预处理，至稳定的循环伏安曲线（通常为），备用。将预处理后的金电极浸入.硅溶胶、.（）、.半胱氨酸（）、.（质量分数为）、.金溶胶的均匀混合液中，约后取出，在下放置后得到酶电极。酶电极的电化学行为各电极在磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线如图所示。由图可知，裸电极（曲线）和不加酶的修饰电极（曲线）没有电化学响应，而酶电极（曲线）出现了一对准可逆的氧化还原峰，在扫速为.时，其氧化峰电位为.，还原峰电位为.，这应该是葡萄糖氧化酶在电极表面发生电化学反应产生的。其氧化还原峰峰电流基本相同，因此，该反应是准可逆的直接电化学反应，式量电位约为.。与固定的电极相比较13，其式量电位显著正移，这可能是在金纳米粒子的表面形成了氧化物从而起到了一种潜在的促进剂作用，。酶电极的氧化峰电流和还原峰电流均随电位扫描速率的增加而增大，二者在.的扫速范围内呈良好的线性关系。随扫速的增加，阴极峰电位负移，阳极峰电位正移，电极过程可逆性变差。溶液的酸度会影响固定化的活性，同时影响有质子参与的催化氧化过程。随着缓冲溶液的增加，式量电位呈线性下降，斜率为。图说明了检测底液对传感器循环伏安阴极峰电流的影响。在时，酶电极的电化学活性最高。酶电极制备条件的优化本文采用硅酸作为溶胶凝胶的前驱体，与采用烷基硅的前驱体相比，避免了乙醇的产生，有利于酶活性的保持。硅溶胶凝胶膜的孔径在左右，因此，本实验采用平均粒径为的金纳米粒子，可保证纳米粒子在膜中的固定而不流出。图为金纳米粒子的紫外可见光谱图和透射电子显微镜图。当每毫升混合溶液中金溶胶的量大于.时，可得到稳定的电流响应。电极的酶负载量是一个极重要的因素。图为不同酶固定量与阴极峰电流的关系。从图中可看出，当体系中含量在时，酶电极的峰电流响应最大。本实验采用加入的。-的浓度也显著影响酶电极的电流响应。图为体系中加入-对酶电极阴极峰电流的影响。随着-浓度的增加，峰电流随之增大，浓度达到.后趋于稳定。-的加入，可通过自组装的方式在电极与酶之间形成一座桥梁，有利于酶与电极间的电子传递。因此，本文中加入-量为.。酶电极对葡萄糖的安培响应为了考察固定在电极表面的是否保持其生物电催化活性，本文研究了酶电极对葡萄糖的电化学响应。图为典型的酶电极对葡萄糖的电流与时间响应曲线。传感器对葡萄糖的响应时间小于，说明该反应是一个快速过程。这可能硅溶胶凝胶薄膜是多孔网状结构，金纳米粒子的加入有利于酶在电极表面的取向并增加了导电性，有利于酶与电极间的电子传递作用。传感器对葡萄糖的线性响应范围为.，线性回归方程为（）.（），检出限为。检测灵敏度与酶介体型葡萄糖氧化酶电极16相近，优于金纳米粒子固定的葡萄糖氧化酶电极17.18。抗干扰性能葡萄糖生物传感器在测试血液样品时，主要的干扰可能来自具有电化学活性的抗坏血酸和尿酸。该酶电极的工作电位低（.），因此具有很高的选择性，对于.的葡萄糖，同样量的抗坏血酸和尿酸均不产生明显的干扰。酶电极的稳定性与重现性取支不同修饰的酶电极对.的葡萄糖溶液进行测试，相对标准偏差为.。同一酶电极对.的葡萄糖溶液平行测定次，标准偏差为.。当酶电极在下保存，并间断使用后，该电极对葡萄糖的响应仍保持初始响应的。电极稳定性显著优于文献报道，的和。说明葡萄糖氧化酶与金纳米粒子同时固定于硅凝胶的三维网络结构中，可很好地保持酶的催化活性。样品测试采用标准加入法测定血清样品中葡萄糖的浓度，测得值与健康人体血液中的正常值相符，回收率在 之间。3 溶胶一凝胶血红蛋白电化学传感器的研制 玻碳电极的处理将玻碳电极用氧化铝粉抛光，在二次水和无水乙醇中分别超声洗涤5 min，并重复3次，然后进行电化学活化处理，即在05 molL的H2SO4中于一O3 V15 V进行循环伏安(CV)扫描，直到获得稳定的循环伏安响应储备液的配制血红蛋白(Hemoglobin，Hb)储备液：称取50 mg牛血红蛋白，用水稀释，并定容至1O ml的容量瓶中，避光4保存，使用时逐级稀释溶胶一凝胶储备液：在室温下将1ml正硅酸乙酯，02ml 01 molL的HC1和3 ml水、1Oml乙醇混合于20ml密封瓶中，超声震荡30min，至形成均一溶胶液，密封存放于阴暗处表面活性剂储备液：称取025 g十六烷基三甲基溴化铵，加10ml乙醇溶解，用水定容至25ml，密封保存HbSolGelGC修饰电极的制备取配制好的溶胶一凝胶储备液和表面活性剂储备液各1 ml，搅拌均匀后加入05 ml血红蛋白(Hemoglobin，Hb)储备液，置于一密闭容器中超声震荡5 rain，使其分散均匀吸取8 L该溶液，均匀涂敷在玻碳电极表面，置于4冰箱中干燥10 h以上，即可制得HbSolGelGC修饰电极该电极不用时可将其置于邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH一6)中并放入4冰箱中保存相同条件下制备SolGelGC电极作为比较电极 电化学实验采用三电极体系：AgAgCl(饱和KC1)电极为参比电极、铂丝为辅助电极、HbSolGelGC修饰电极为工作电极；缓冲液为邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH 一6)实验时先向溶液中通氮气10 min，并保持缓冲液在实验过程中的氮气气氛Hb和SolGel的紫外一可见吸收光谱 用紫外一可见吸收光谱考察了Hb在溶胶一凝胶溶液中的吸收曲线，结果如图2所示其中图2a为溶胶一凝胶溶液的Soret吸收带曲线，图2b为Hb的Soret吸收带曲线，图2c为Hb在溶胶一凝胶溶液中的Soret 利用溶胶一凝胶技术将血红蛋白固载于玻碳电极表面，并用循环伏安法、方波伏安法和紫外一可见吸收光谱研究了血红蛋白在修饰电极上的电化学行为实验发现血红蛋白包埋在溶胶一凝胶中，能在玻碳电极上实现蛋白质的直接电子转移，表明溶胶一凝胶与血红蛋白有较好的生物兼容性实验同时找出了HbSolGelGC修饰电极的最佳制备条件，表明该传感器具有制作方法简单，有较好重现性、稳定性以及高灵敏度等优4 基于掺杂碳纳米管的复合体系电化学生物传感器 碳纳米管(CNTs)具有特殊的结构特征，独特的电学和力学性质。由于CNTs有较高的电催化能力，并能促进酶反应的电子传递，因此已逐渐用于生物传感器的制作_j 。Rubianes等跚率先研究了CNTs修饰电极的性能，证明了CNTs具有电化学催化能力。Wang等 研究了用萘酚分散CNTs用于制备安培型生物传感器，并报道了将CNTs分散在Teflon中，利用cNTsTeflon复合膜制备电化学传感器和生物传感器。铂纳米颗粒(NSPt)因其独特的催化能力而引起人们的重视。由于它能促进电子转移并容易在电极上修饰，因此也逐渐用于电极设计和制作 。通过将多壁碳纳米管(MWCNTs)分散于正硅酸四乙酯(TEOS)溶胶一凝胶和含有NSPt的壳聚糖(CHIT)混合体系中，研制了一种新的电化学生物传感器。由于CNTsNSPt修饰电极结合了CNTs和NSPt二者的优点，因此使研制的生物传感器达到很好的电化学检测效果。在CNTs-NSPt的修饰中，采用溶胶一凝胶技术不但解决了CNTs的分散问题，同时也实现了铂纳米颗粒在玻碳(GC)电极上的固定，使提出的复合膜修饰电极的催化能力和灵敏度明显提高 ”。本文将葡萄糖氧化酶(GOx)加入到上述复合体系中，制备了一种性能优良的葡萄糖生物传感器。循环伏安分析和电流分析测量在CHI760电化学工作站中进行。NSPtCHIT透射电镜(TEM)图像由Hitachi H一800(Hitachi，Tokyo，Japan)获得。扫描电子显微镜(SEM)图像由JSM-5600LV(JEOL，LtdJapan)获得。电化学实验采用三电极系统：以修饰玻碳电极(GC)为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极。所有测量和报道的电位均相对于SCE，所有实验均在室温下进行。MWCNTs的净化多壁碳纳米管(MWCNTs)根据文献l_1 5方法进行净化。即100 mg MWCNTs在400条件下氧化 30 rain以除去无定形碳颗粒。为了除去金属氧化物催化剂，将氧化的CNTs分散到60 mL 60 molLHC1中超声搅动4 h，并洗至溶液呈中性，然后在室温下干燥。溶胶一凝胶的制备溶胶一凝胶参照文献19方法制备。即将104 g TEOS，18 g水，46 g乙醇，30 L 01 molL HC1及10 L Triton X一100混合，在室温下搅动4 h左右，直至获得澄清溶液。含有铂纳米颗粒壳聚糖的制备05wt CHIT溶液制备如下：将50 mg壳聚糖溶解于10 mL 10 乙酸中，在室温下搅拌3 h，直至完全溶解。再用浓NaOH溶液将pH 值调至3040，然后加入1 mL 001 molL HzPtC1 ，超声10min，最后加入005 mL新配制的5 NaBH 溶液将高价铂还原成铂纳米粒子。电极的修饰玻碳电极(GC，直径4 ram)首先用金相砂纸和氧化铝打磨抛光，超声10 min，并用蒸馏水冲洗。将05 mL TEOS溶胶一凝胶溶液和05 mL含有铂纳米颗粒的壳聚糖溶液混合，然后将6 mg净化的MWCNTs分散于该混合液中。取8 L配制的分散液滴在玻碳电极上，并在室温下干燥。葡萄糖生物传感器的制备将1 mg葡萄糖氧化酶溶解于50 L CNTsNSPt分散液中，取8 L所得的混合液滴加在GC电极上，在冰箱中4干燥保存。电镜分析图1A是NSPtCHIT典型的TEM 图像。壳聚糖中分散均匀的NSPt平均尺寸为30 nm 的球形颗粒。在4的条件下，将壳聚糖在黑暗处放置两个月后仍看不到明显的团聚，表明铂纳米粒子在壳聚糖中很稳定。图1B为用乙醇分散的MWCNTs的典型SEM 图像。如图所示，净化的MWCNTs具有中空结构，直径为3080 nm。从图中还可以看出，MWCNTs大部分表面分布良好，基本以小束或单管形式存在。考察了CNTsNSPt复合膜修饰电极在不同扫速下的循环伏安(CV)行为。图2为扫速在00104Vs范围内，修饰电极对包含02 molL KC1的20 mmolL Fe(cN) 一的循环伏安图。图中可以清楚地看到伏安响应的变化很大。阳极和阴极峰电流都随扫速的增大而增大，表明是准可逆行为。在扫速1O400 mVs范围内，峰电流和扫速的平方根成线性关系(内插图)，相关系数为0995。作为对照，分别用CHIT+NSPt、TE0S+CNTs并和TEoS+CNTsNSPt固定在GC电极上测试电极的性能。三种电极对连续加入2 mmolL H。O。的电流响应如图3所示。NSPt修饰的玻碳电极，响应信号微弱，CNTs修饰的玻碳电极对双氧水浓度的改变响应迅速，但其灵敏度不如CNTsNSPt复合膜修饰电极。CNTsNSPt复合膜修饰电极的电流响应值比CNTs修饰电极大35倍，比NSPt修饰电极大8 倍。结果表明这种复合膜修饰电极具有CNTs和NSPt的协同效应，使电极对H O 有较宽的检测范围。此外，电极对H O 的响应快速，稳定。实验考察了MWCNTs浓度对电极响应的影响。通过改变MWCNTs的浓度，比较电极对H O 的电流响应。实验表明，MWCNTs的浓度从2 mgmL增大到6 mgmL时，电极的灵敏度也随之提高。但MWCNTs的浓度继续增大时，复合膜的机械稳定性变差，本文选用MWCNTs浓度为6 mgmL。 葡萄糖生物传感器的响应特征利用CNTsNSPt复合膜修饰的玻碳电极具有良好的电化学响应，通过固定葡萄糖氧化酶可制备葡萄糖传感器。制膜中发现，CHIT与TEOS溶胶一凝胶的体积比较小时，膜易碎，体积比过大时，则酶易泄漏，二者都影响传感器的稳定性。实验中取两者的体积比为1：1。图4为分别采用CNTsGOx和CNTsNSPtGOx修饰膜的两种葡萄糖生物传感器对连续加入02 mmolL葡萄糖的电流响应，可见两种传感器对葡萄糖的响应都很快速，但CNTsNSPtGOx膜的传感器具有较大的响应信号和较宽的线性范围。测得CNTsNSPtGOx膜传感器的线性范围为0058 mmolL，相关系数为0996，响应时间和检出限(SN一3)分别为3 S，10 gmolL。本文中的复合膜电极，由于结合了CNTs和NSPt二者共同的催化能力，利用了两者之间的协同效应，能实现在较低电位条件下对葡萄糖的检测，因而可显著减少一些氧化还原物质对测定的干扰。对1 mmolL的葡萄糖连续测定10次，测得响应电流值的相对标准偏差为45 ，电极的重现性较好。用同样的方法制备6支电极，分别用于测定1 mmolL的葡萄糖溶液，测得响应电流值的相对标准偏差为52 ，表明此方法的重复性较好。该电极使用一个月后(约反复使用80次)，电流响应值为原始值的85 ，表明采用溶胶一凝胶技术所制得复合膜酶传感器具有较长使用寿命。为了对提出的电化学生物传感器进行初步评价，测定了尿样中葡萄糖的回收试验。尿样稀释100倍，改变加入尿样中的葡萄糖的浓度进行回收率测定，结果见表1。可见该传感器测得的回收率为950 1033 。5 结论与展望以上综述了溶胶凝胶技术在电化学传感器中的应用及进展， 国家标准方法(分光光度法)仅能测定苯酚、邻甲酚、间甲酚，无法测定其它酚类。而采用溶胶一凝胶法 对苯酚、邻甲酚、对氯苯酚、邻苯二酚、间甲酚响应较好。生物酶同含有苯及苯系物的化工废水接触将很快失活，采用溶胶一凝胶法在碳糊中固定生物酶制备生物传感器，解决了此问题。采用溶胶-凝胶技术将金纳米粒子和葡萄糖氧化酶一次性固定于硅溶胶-凝胶的网络结构中，制备了葡萄糖生物电化学传感器 。该酶电极灵敏度高、响应快、稳定性好。血红蛋白包埋在溶胶一凝胶中，能在玻碳电极上实现蛋白质的直接电子转移，表明溶胶一凝胶与血红蛋白有较好的生物兼容性。在CNTs-NSPt的修饰中，采用溶胶一凝胶技术不但解决了CNTs的分散问题，同时也实现了铂纳米颗粒在玻碳(GC)电极上的固定，使提出的复合膜修饰电极的催化能力和灵敏度明显提高。 将葡萄糖氧化酶(GOx)加入到上述复合体系中，制备了一种性能优良的葡萄糖生物传感器。随着纳米技术的飞速发展，纳米材料在医学成像、疾病诊断、药物传输、基因治疗等多个领域显示了巨大的优势。对于生物传感领域而言，纳米材料在光学性能、电学性能、磁学性能、力学性能和化学活性等方面表现出的独特性能使其成为很好的换能器元件；另一方面，生物传感器中的分子运作本身就是基于纳米层次，纳米材料的参与可以将其优良的性能很好地整合到分子运作中，从而改进甚至革新分子运作的体系。鉴于以上特点，溶胶凝胶技术结合纳米材料在生物传感器中的应用将引起 越来越多科研工作者的兴趣。References：1 Duesberg G S，Roth S，Downes P，Minett A，Graupner RChemMaterJ，2003，15(17)：33142 Zhang M，Smith A，Gorski WAna1ChemJ，2004，76(17)：50453 Chen R S，Huang W H，Tong 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