用体外致敏联合EB病毒转化技术构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库.doc

用体外致敏联合EB病毒转化技术构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库 作者：水漩，李官成，李跃辉，黄建，赵艳 【摘要】 目的 构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库。方法 体外致敏并用EB病毒(EBV)转化肝癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。RTPCR扩增人抗体轻链和重链Fd段基因，将抗体基因分别与载体pComb3连接后，电转化大肠杆菌XLIBlue，构建噬菌体呈现型Fab抗体库。结果 经EBV转化的4例肝癌患者PBMC，ELISA检测均有抗肝癌抗体产生；经PCR扩增出13条轻链基因片段(、)和28条重链Fd基因片段()；电转化构建的噬菌体抗体库库容为1.7107puf/mL；Fab基因的重组率约为100%。结论 用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术，成功构建了全人源抗肝癌Fab组合抗体文库。 【关键词】 EB病毒转化；噬菌体抗体库；肝癌；Fab抗体Construction of phage antibody library using sensitized in vitroBlymphocytes of liver cancer patientsABSTRACT: Objective To construct human phage antibody library against hepatoma carcinoma. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with liver cancer were sensitized in vitro and transformed by EpsteinBarr virus (EBV). The genes of light chain and Fd of antibodies were amplified by RTPCR. Fab genes were cloned into vector pComb3 and transformed into E.coli XLIBlue by electroporation to construct the Fabdisplaying phage antibody library. Results ELISA detection showed that 4 liver cancer patients B cells transformed by EBV could produce specific antibodies to hepatoma carcinoma cell. Totally 13 types of light chain genes and 28 types of Fd genes were obtained by RTPCR. The capacity of the primary phage library was 1.7107pfu/mL. The percentage of recombinant clones was about 100%. Conclusion A human phage antibody library has been constructed successfully by means of EBV transformation technique.KEY WORDS: EBV immortalization; phage antibody library; liver cancer; Fab fragment肝癌是一种恶性程度极高的肿瘤。目前，其治疗手段仍以手术切除为首选，但复发率极高，且常用的化疗药物对肿瘤的杀伤作用缺乏特异性，常导致明显的副作用。近年来以抗体为基础的免疫疗法、肿瘤靶向治疗和基因治疗成为肿瘤治疗研究的热点，部分已经在实验室甚至临床上取得了初步的效果12。利用噬菌体抗体库技术，可克服杂交瘤技术制备人源性单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)的复杂过程，而且可筛选出多种特异性抗体34。本研究以肝癌患者外周血淋巴细胞作为基因来源，联合体外致敏和EB病毒(Epstein Barr virus, EBV)转化技术构建全人源的抗肝癌Fab段噬菌体抗体库，为进一步筛选获得高亲和力、高特异性的Fab抗体奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料 肝癌细胞株HepG2、绒猴淋巴母细胞样细胞系B95.8，由本室保存。大肠杆菌XL1Blue、噬菌粒载体pComb3及辅助噬菌体VCSM13均由本室保存。胎牛血清(fetal calf serum，FCS)及新生牛血清(newborn calf serum, NBS)为杭州四季青公司产品；rhIL2、谷氨酰胺、丙酮酸钠及环孢菌素A均为Sigma公司产品；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗人IgG/M购自Pharmacia Biotech公司；TRIzol为Invitrogen公司产品；cDNA合成试剂盒为Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒购自北京百泰克公司；Taq DNA酶、限制性内切酶Xba、Sac、Xho和Spe为Fermentas公司产品；T4连接酶为Promega公司产品。20份肝癌患者(经病理检查确诊)的外周血标本分别采自湖南省肿瘤医院和中南大学湘雅附属第二医院，术前1d采血。1.2 方法1.2.1 肝癌细胞抗原的制备 将培养的肝癌细胞(HepG2)用25g/L胰酶消化并计数，按106细胞加0.5mL丝裂霉素C(1g/L)，于37处理30min，每10min摇动一次。用DHanks液洗4次后，加入含10g/L FCS的RPMI1640培养基，分装，保存于-20。1.2.2 肝癌患者PBMC的分离 无菌抽取20例肝癌患者外周血各5-8mL，采用密度梯度离心法分离PBMC。用含有50mL/L超级NBS的DHanks液洗4次，于显微镜下计数细胞后，按109个细胞/L加入含100ml/L FCS的RPMI1640完全培养基(含4mmol/L谷氨酰胺和2mmol/L丙酮酸钠)中，于24孔板中培养。1.2.3 肝癌患者PBMC的致敏 将肝癌患者的PBMC分成两组：一组用肝癌细胞抗原致敏，按肝癌细胞PBMC=110加入PBMC 中，于37培养3-4d后用EBV转化；另一组不用肝癌细胞抗原致敏，于第2天直接EBV转化。两组所用培养基均为含10g/L FCS的RPMI1640完全培养基(含2104u/L IL2及2mg/L环孢菌素A)。1.2.4 EBV的转化 培养B95.8细胞至对数生长期，离心、取上清，经孔径为0.22m的滤膜过滤后，收集滤液，保存于-70。PBMC体外致敏后，吸弃每孔中的培养上清，按4106 PBMC加入1mL EBV培养上清，于37孵育3h，吸弃上清，加入含100mL/L FCS的RPMI1640完全培养基，培养2周后，换用含200ml/L NBS的RPMI1640完全培养基。1.2.5 转化细胞培养上清的筛选 采用间接ELISA法。以肝癌细胞HepG2作为肿瘤细胞抗原板，经15mL/L戊二醛固定10min，用10g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)37封闭2h，PBST洗板5次。分别加入收集的B细胞培养上清，37孵育2h或4过夜，依次以PBST和PBS洗板各3次，再加入HRP标记的羊抗人IgG/M(HRPGAHIgG/M)，于37作用2h后，用2,2连氮双(3乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS)显色，于波长405nm处测定吸收(A)值。阴性对照为含100mL/L FCS的RPMI1640培养基。阳性阈值为阴性对照孔的A405值(均值)与3倍标准差之和。1.2.6 提取总RNA及cDNA第一链的合成 将培养上清检测呈阳性的细胞扩大培养。用TRIzol试剂分别提取扩大培养的B细胞中的总RNA。混合后，用cDNA合成试剂盒反转录为cDNA(第一链合成)。1.2.7 抗体基因的PCR扩增 采用表1中美国Scripps研究所设计的引物。以cDNA第一链为模板，在TaqDNA酶作用下，进行PCR扩增重链Fd部分VH+CH1和轻链、链的全长基因。PCR扩增条件为：94 30s，55 1min，72 1min，共35个循环，再于72延伸10min。回收抗体基因并测定其浓度。表1 用于扩增人Fab基因的引物（略）Table 1 The primers for amplification of human Fab fragments1.2.8 噬菌体抗体库的构建 取PCR扩增的轻链抗体基因约500ng及pComb3质粒约1g，在150L的酶切体系中，用Sac和Xba于37进行双酶切反应4h。酶切产物以琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将纯化的载体和轻链基因以适当比例混合在室温下连接过夜，将连接产物纯化后电转化大肠杆菌XL1Blue。取少量菌液涂平板鉴定库容，其余的细菌进行培养扩增后， 提取质粒获得轻链基因质粒文库。以Xho和Spe对重链基因的混合物和轻链基因质粒文库进行酶切，纯化后连接并电转化大肠杆菌XL1Blue。加入2mL SOC培养液，于37缓慢摇动1h后，取少量菌液涂平板鉴定库容。其余菌液加入到100mL SB培养液内(含氨苄青霉素20mg/L及四环素10mg/L)摇动1h，补加Amp至50mg/L，继续摇菌2h。加入辅助噬菌体VCSM13 1mL(1012puf)，继续摇菌1h，加入卡那霉素至终浓度为70mg/L，继续培养过夜。次日，离心收集细菌培养上清，加入PEG8000(聚乙二醇)和NaCl，至终浓度分别为4%和3%，搅拌溶解置冰浴30min后，于4以15000g离心15min。弃上清，沉淀悬浮于2mL PBS(pH 7.2)内，即得噬菌体抗体库。1.2.9 Fab抗体基因插入率的检测 随机挑取10个上述转化后的XL1Blue菌落，过夜培养后提取质粒，用Xab和Xho进行双酶切，鉴定噬菌体DNA轻、重链基因的插入率。2 结果2.1 EBV的转化 成功转化4例经肝癌细胞抗原致敏的肝癌患者B细胞。用肝癌细胞抗原体外致敏的PBMC培养至6-8d时，可见集落样淋巴母细胞化。在加入EBV上清后，细胞的形态表现相似，开始可见大量淋巴细胞死亡。2周左右时，可见肝癌细胞抗原致敏组的细胞有少量克隆生成，主要分布于孔周围，并逐渐长成团(图1)。4周左右时，将细胞加于25cm2的一次性塑料瓶中扩大培养，再过4-6周左右收集细胞。2.2 EBV转化的B细胞抗体的检测 用肝癌细胞抗原致敏并经EBV 转化的4例肝癌患者的PBMC，其培养上清均可检测出有抗肝癌特异性抗体的产生。而未致敏组培养6-8d后，检测其上清均为阴性。2.3 RNA的鉴定 抽提4例经EBV成功转化的肝癌患者B细胞的总RNA ，电泳后呈明显的3条带(图2)，即rRNA28s、rRNA18s和rRNA5s，A260/A280值>1.8。说明提取的总RNA质量良好。2.4 抗体基因的扩增 分别用8对链基因引物、5对链基因引物和32对重链基因引物，扩增出8条链基因(VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8)、5条链基因(V1A、V1S、V2A、V3A、V3B)和28条重链基因(3种VH1A、4种VH1F、3种VH2F、4种VH3A、4种VH3F、4种VH4F、3种VH6F和3种VH6A)。重链Fd段基因的长度约660bp，轻链基因的长度约660bp。DNA凝胶电泳结果如图3、4所示。图1 EBV转化的B淋巴细胞（略）Fig.1 EBVtransformed B lymphocytes图2 从EBV转化的B细胞提取总RNA（略）Fig.2 Electrophoresis of total RNA from EBV transformed B lymphocytes2.5 噬菌体抗体库的建立 将FabpComb3经电穿孔法导入感受态细菌XL1Blue。经氨苄青霉素及四环素筛选后，得到库容约为1.7107的初级噬菌体抗体库。从中随机挑取10个克隆进行酶切鉴定抗体轻、重链基因的插入率。若轻、重链共同插入，应切出2200bp左右的条带，酶切结果如图5所示，插入率约为100%。3 讨论 抗体作为药物或药物的运载工具，可用于多种疾病的诊断和治疗。但鼠源性单克隆抗体(mAb)的免疫原性极大地限制了其在临床上的应用。近年来，随着噬菌体表面展示技术的发展，人们已可制备全人源化的mAb，以克服应用鼠抗体的缺点，并具有高活性、低毒性和高成功率的优势，显示出良好的治疗应用前景。我们实验室利用已获得的噬菌体抗体筛选到两个可能为新基因的大肠癌抗原基因5。 图3 轻链基因的PCR扩增（略）Fig.3 Cloning immunoglobulin light chain genes by PCRLane M: DL2000 Markers; Lane 1-5(A): VK1d as 3primer, VK1a, VK1s, VK2a, VK3a, VK3b as 5primer; Lane 6-13(B): CL2 as 3primer, VL1, VL2, VL3,VL4,VL5 VL6, VL7, VL8, VL9 as 5primer图4 重链可变区的PCR扩增（略）Fig.4 Cloning immunoglobulin variable region genes of heavy chain by PCRLane M: DL2000 Markers; Lane1-10: The PCR products of different human Fd chain图5 重链库插入率的鉴定图（略）Fig.5 Ratio of Heavy Chain InsertionLane M: DNA/EcoR+Hind Marker; Lane 1-10: Identification of random 10 clones by digestion with Xba/Xho 抗体库的构建是人源抗体制备的关键步骤6，对酶切、连接及转化的各步条件都要认真摸索，以尽量增大库容量。我们发现在连接时载体易发生自连，造成无效克隆，而在载体酶切后对其进行去磷酸化，可以提高连接效率，减少无效克隆。另外，在克隆连接过程中通过延长连接时间，增加连接酶的使用浓度的方法，尽可能地增加连接效率。 在构建抗体库时我们采用肝癌细胞抗原对从患者外周血中分离的B淋巴细胞进行体外刺激，使B细胞内抗体可变区基因发生高突变，使其产生特异性抗体的能力获得提高7，同时通过EBV转化技术使B细胞永生化，从而可用基因工程技术大量获得所需抗体。EBV通过病毒表面蛋白gP350/220与细胞表面的补体受体(CR2/CD21)结合而进入被感染的B细胞，从而使B细胞能够在体外连续传代，并使数量较少的抗原特异性B细胞得到增殖，从而使产生特异性抗体的免疫球蛋白基因得到富集，同时减少下游基因操作步骤中特异性抗体基因片段VH/VL的丢失，增加VH/VL原始配对的机率8。 通过以上方法，我们构建了一个库容量达1.7107克隆的全人源的Fab抗体库,酶切鉴定Fab基因的插入率约为100%，为进一步用肝癌细胞筛选特异性抗肝癌Fab抗体奠定了实验基础。基金项目：湖南省卫生厅科研基金重点资助项目(No.A2003001)【参考文献】 1Hudson PJ, Souriau C. Engineered antibodies J. Nat Med, 2003, 9(1):129134.2Anna Wu, Peter DS. Arming antibodies: prospects and challenges for immuneoconjugates J. Nat Biotech, 2005, 23(9):11371146.3Brissette R, Prendergast JK, Goldstein NI. Identification of cancer targets and therapeutics using phage display J. Curr Opin Drug Discov Devel, 2006, 9(3):363369.4Pavoni E, Flego