酵母双杂交技术筛选与Fbxl16相互作用的蛋白质.doc

酵母双杂交技术筛选与Fbxl16相互作用的蛋白质【摘要】 目的: 寻找体内能够与Fbxl16相互作用的蛋白质,用以揭示该蛋白的功能及其在脊髓损伤修复过程中的作用.方法: 通过RTPCR技术克隆scirr1基因编码区序列,将其克隆入pSos载体以构建质粒pSosscirr1. 把该重组质粒表达的融合蛋白hSosFbxl16作为诱饵蛋白,用改良的酵母双杂交技术筛选大鼠脑cDNA文库中能与Fbxl16相互作用的蛋白质,最后用酵母双杂交回转实验对获得的相互作用的可靠性加以验证. 结果: 成功构建了融合蛋白表达质粒pSosscirr1之后,筛选出了14个与Fbxl16阳性相互作用的蛋白质；通过回转实验验证,确定其中两个蛋白能与Fbxl16相互作用,分别是cAMP依赖蛋白激酶型催化亚基（protein kinase, cAMPdependent, catalytic, alpha, Prkaca)和衣被蛋白复合物亚基（coatomer protein complex, subunit zeta 1, Copz1). 结论: Fbxl16和Prkaca的相互作用为解释cAMP通路与脊髓损伤的关系提供了新思路，提示Fbxl16与细胞内物质转运有关. 【关键词】 脊髓损伤 Fbxl16 蛋白质相互作用 Prkaca Copz1 0引言 Fbxl16,又称Scirr1,是一个新发现的蛋白质,计算生物学研究结果表明它具有“Fbox+LRR”结构域,在脊髓损伤后表达明显增加1. 为了研究该蛋白的功能以及在脊髓损伤修复中的作用,我们通过RTPCR技术克隆出scirr1基因编码区序列,将其克隆入pSos载体以构建质粒pSosscirr1. 把该重组质粒表达的融合蛋白hSosFbxl16作为诱饵蛋白,用改良的酵母双杂交技术筛选大鼠脑cDNA文库中能与Fbxl16相互作用的蛋白质,最后用酵母双杂交回转实验对获得的相互作用的可靠性加以验证,以期找到能与Fbxl16相互作用的蛋白质. 1材料和方法 1.1材料成年雄性Wistar大鼠1只,体质量220250 g,由军事医学科学院提供. PCR引物由上海生工合成. 质粒提取和PCR产物回收试剂盒购自Stratagene公司. Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、NcoI和SalI内切酶购自Qiagen公司. 酵母双杂交试剂盒CytoTrap XR Premade Libraries kit购自Stratagene公司. 1.2方法 1.2.1RTPCR克隆scirr1基因编码区序列用Trizol方法提取大鼠脊髓总RNA；上、下游分别引入NcoI和SalI酶切位点设计scirr1引物,上游：5GAG CCA TGG TGA TGT CGA GCC CTG GTA TC3,下游： 5GAC GTC GAC CTA TTC AAT GAC GAG GCA GC3, RTPCR扩增scirr1基因编码区. 用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物,按标准程序纯化回收以及酶切目的条带中的DNA产物,送上海生工测序. 1.2.2构建融合表达质粒扩大培养pSos质粒的保存菌种,采用DNA抽提试剂盒提取pSos质粒,用NcoI/SalI双酶切并纯化回收质粒. 将线性化质粒和酶切后的scirr1编码区DNA行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,成像拍照后,采用TotalLab软件进行定量. 将线性化质粒和酶切后的scirr1编码区DNA按照17的摩尔比进行重组连接,将重组载体转化感受态BL21型大肠杆菌,酶切鉴定后送上海测序鉴定. 1.2.3酵母双杂交文库筛选使用诱饵质粒pSosscirr1,温度敏感型cdc25H酵母突变株和5个对照质粒(pSos, pMyrLamin C, pSosMAFB, pMyrMAFB和pMyrSB) 进行酵母双杂交预实验,用以排除Fbxl16的毒性和自激活. 之后按照酵母双杂交手册以pSosscirr1为诱饵质粒筛选大鼠脑cDNA文库pMyrcDNA. 筛选与Fbxl16阳性相互作用的cDNA融合质粒,这些质粒将用于下一步的回转验证. 1.2.4回转验证阳性相互作用将筛选出的每个cDNA融合质粒分别与pSosscirr1共转化入酵母突变株进行回转验证. 在葡萄糖和半乳糖培养基上都不生长的克隆是假阳性相互作用克隆；在葡萄糖缺陷培养基上不生长而在半乳糖缺陷培养基上生长的克隆是真阳性相互作用克隆. 之后从验证为真阳性的克隆中提取cDNA融合质粒，扩大培养后纯化、测序, 从NCBI数据库中查出该cDNA对应的蛋白质. 该蛋白就是能够与Fbxl16相互作用的蛋白质. 2结果 2.1融合蛋白表达质粒的构建引入NcoI和SalI酶切位点,将RTPCR得到的scirr1基因编码区片段克隆入pSos空载体,构建出融合蛋白表达质粒pSosscirr1（图1）. M1: DNA marker DL15 000; M2: DNA marker DL2000; 1: NcoI和SalI双酶切重组质粒pSosscirr1. 图1重组质粒pSosscirr1的酶切鉴定 2.2酵母双杂交文库筛选预试验排除了Fbxl16的毒性和自激活, 酵母双杂交筛选出14个阳性相互作用克隆，它们在同源复制的两块葡萄糖培养基上不生长，而在另两块同源复制的半乳糖培养基上生长（图2）. A,C: 葡萄糖缺陷培养基上克隆不生长； B,D: 半乳糖缺陷培养基上克隆生长. 图2文库筛选出的一个阳性相互作用克隆 2.3回转验证阳性相互作用从筛选出的14个克隆中提取cDNA融合质粒，分别与pSosscirr1共转化入酵母突变株回转验证. 结果表明其中2个克隆为真阳性相互作用，其他的克隆为假阳性. 将这2个真阳性相互作用克隆扩大培养、纯化、提质粒后测序, 从NCBI数据库中查出该cDNA融合质粒对应的蛋白质分别为Prkaca和Copz1，即蛋白Prkaca和Copz1是能够与Fbxl16相互作用的蛋白质（图3）. A: 假阳性相互作用克隆; B,C: 真阳性相互作用; A1，B1，C1: 葡萄糖培养皿；A2，B2，C2： 半乳糖培养皿. 图3回转实验验证阳性相互作用 3讨论 cAMP通路在急性脊髓损伤中表现出重要意义：刺激cAMP信号通路能够提升受损感觉神经元的内在生长能力2；神经营养因子能增加神经元的cAMP水平，激活cAMP通路，继而阻断鞘磷脂相关糖蛋白对脊髓损伤后神经元再生的抑制3；在脊髓损伤局部和在大脑运动皮层给入cAMP能诱导大鼠脊髓损伤后神经再生4. Prkaca是体内该酶催化亚基的主要存在形式5，在急性脊髓损伤中发挥重要作用. 脊髓损伤修复相关蛋白Scirr1和蛋白激酶A催化亚基Prkaca相互作用的发现无疑为解释cAMP通路与脊髓损伤的关系，进而为阐明脊髓损伤的分子机制带来新的思路. Copz1，即衣被蛋白复合体1亚基，是衣被蛋白I（COPI）的组成蛋白，COPI是一种构成运输膜泡表面衣被的蛋白复合体，负责从高尔基体向内质网的膜泡运输6. 此两者相互作用的发现提示Fbxl16可能与细胞内物质转运有关.【参考文献】 1 Liu T, Ma Z, Que H, et al. Identification and characterization of scirr1, a novel gene upregulated after spinal cord injuryJ. Exp Mol Med, 2007,39:255-266.2 Neumann S, Bradke F, TessierLavigne M. Regeneration of sensory axons within the injured spinal cord induced by intraganglionic cAMP elevation J. Neuron, 2002,34(6):885-893.3 Cai D, Shen Y, De Bellard M. Prior exposure to neurotrophins blocks inhibition of axonal regeneration by MAG and myelin via a cAMPdependent mechanism J. Neuron, 1999,22:89-101.4 Han PJ, Shukla S, Subramanian PS, et al. Cyclic AMP elevates tubulin expression without increasing intrinsic axon growth capacity J. Exp Neurol, 2004,189:293-302.5 Morris RC, Morris GZ, Zhang W. Differential transcriptional regulation by the alphaand gammacatalytic subunit isoforms of cAMPdependent protein kinaseJ. Arch Biochem Biophys, 2002,403(2):219-228.6 Benicho