PPARγ通路在舒林酸抑制胃癌细胞增殖中的作用及机制.doc

PPAR通路在舒林酸抑制胃癌细胞增殖中的作用及机制 作者：吴克俭，费素娟，刘军权，陈复兴【摘要】 目的 了解舒林酸是否通过过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR）途径影响人胃癌SGC- 7901细胞的增殖，初步探讨PPAR途径在舒林酸抗肿瘤作用中的机制。方法 培养人胃癌SGC-7901 细胞，经特异的PPAR抑制剂GW9662作用，采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测舒林酸对细胞增殖的影响及用免疫细胞化学法检测PPAR、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 MTT法显示GW9662作用后，舒林酸对SGC-7901细胞增殖的抑制作用减弱，细胞增殖增多，而且这种作用在一定范围内呈剂量和浓度依赖性；免疫细胞化学法显示GW9662预先干预与舒林酸单独作用相比，SGC7901细胞的PPAR-蛋白表达明显减少， Bax的表达亦明显降低，而Bcl-2蛋白表达增强(P<0.01) 。结论 PPAR途径在舒林酸抗肿瘤作用中具有一定作用，其机制与激活PPAR对Bcl-2、Bax蛋白的表达有关。 【关键词】 舒林酸；人胃癌SGC- 7901细胞；PPAR通路；GW9662； Bcl-2；Bax Abstract： Objective To investigate the effect of sulindac on the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 and its antineoplastic mechanism via the PPAR pathway, so as to make a preliminary probe into the mechanism of the PPAR pathway in the antineoplastic effect of sulindac. Methods Cultured human gastric cancer cell line SGC-7901 was treated by the specific PPAR inhibitor GW9662, followed by detection of the effect of sulindac on the proliferation of SGC7901 cells by MTT assay and determination of the expressions of PPAR, Bcl-2 and Bax protein by immunocytochemical method, respectively. Results MTT assay showed that the inhibitory effect of sulindac on human gastric cancer SGC7901 cells was attenuated subsequent to GW9662 treatment, with an increase in cell proliferation and in a dose-concentration dependence manner within a certain range. Meanwhile, the immunocytochemical result showed that with GW9662 pre-intervention in sulindac, compared with sulindac administration alone, the expression of PPAR- protein was obviously reduced, so was the Bax expression, while the expression of Bcl-2 was enhanced (P<0.01). Conclusion PPAR pathway has certain role to play in the anti-tumor effect of sulindac, and the underlying mechanism is involved in the activation of PPAR, the up-regulation of Bcl-2 expression and down-regulation of Bax protein expression. Key words: sulindac; human gastric tumor SGC-7901; PPAR pathway; GW9662; Bcl-2; Bax 既往认为非甾体类抗炎药（NSAIDs）发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制环氧合酶-2（COX-2）的活性以拮抗肿瘤细胞增殖，但越来越多的新证据提示这并非是其惟一的抗肿瘤机制，亦可能通过COX-2非依赖途径，如过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR）途径诱导细胞凋亡而实现抗肿瘤效应1-2。目前在临床上，使用非选择性非甾体类抗炎药舒林酸（sulindac）预防结肠多发腺瘤的癌变，并证实PPAR通道抑制剂GW9662能够特异性地结合于PPAR受体285位的半胱氨酸，从而翻转NSAIDs药物拮抗肿瘤细胞增殖的作用3。本研究通过观察舒林酸对人胃癌细胞增殖和Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，采用PPAR通路特异性的抑制剂GW9662干预舒林酸对人胃癌细胞的增殖作用，探讨PPAR通路的特异性激活是否介导了舒林酸抑制胃癌细胞的增殖，旨在进一步明确NSAIDs抗癌作用的机制。1 材料和方法1.1 实验材料和药品人胃癌细胞系SGC-7901购自上海细胞生物研究所。RPMI-1640培养液、小牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；GW9662购自Cayman公司；舒林酸、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；PPAR、Bcl-2、Bax免疫细胞化学一抗、SP试剂盒均购自北京中山生物工程公司。1.2 实验方法1.2.1 细胞培养胃癌细胞株SGC-7901用含10小牛血清、双抗（青霉素1105 U/L及链霉素1105 U/L）的RPMI-1640培养液，以1108/L的细胞密度接种入25 ml的细胞培养瓶中，置于37、5CO2培养箱内培养。GW9662用RPMI-1640培养液配制，均为现用现配。将舒林酸溶解于DMSO中，用RPMI-1640培养液将其配成浓度1.2 mmol/L的原液存于-20冰箱内，按照实验要求用RPMI-1640培养基于磁力搅拌器中稀释溶解。1.2.2 MTT法取对数生长期SGC-7901细胞配成1108/L，接种于96孔板中，每孔0.6 ml，于37、5 CO2培养箱内培养，24 h后加入GW9662（终浓度为0.1、0.5、1、5 mol/L），0.5 h后再分别加入舒林酸（终浓度为0.6 mmol/L）。设阴性对照组和不加GW9662的舒林酸对照组。每个时间每个浓度重复6孔继续培养，于24、48、72 h每孔加入MTT液20 l，37孵育4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150 l，轻轻震荡使充分溶解，在540 nm 波长酶标仪上测定各孔光密度值（D值），求其平均值，同时计算细胞增殖率。1.2.3 免疫细胞化学法检测PPAR、Bcl-2、Bax蛋白表达待细胞生长融合度达到80%左右，除去培养液，4%多聚甲醛固定细胞15 min，Triton破膜10 min，滴加过氧化酶阻断液室温下孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶的活性，滴加正常非免疫动物血清，室温下孵育10 min，滴加相应一抗室温下孵育60 min，分别滴加二抗和链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，DAB显色显微镜下观察，自来水冲洗，苏木素复染，盐酸分化，温水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，干燥后中性树胶封片，同时设置PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：PPAR蛋白、Bcl-2、Bax 均以细胞核染色为棕黄色或深棕黄色为阳性细胞。PPAR蛋白以单纯细胞质着色而胞核无着色，或细胞核、细胞质均无着色为阴性。Bcl-2、Bax 均以单纯细胞核着色而胞质无着色，或细胞核、细胞质均无着色为阴性。高倍镜下选取10个视野，计数1000个细胞中的阳性细胞数（即阳性细胞占计数细胞的百分比）。1.3 统计学处理实验数据采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，所得结果均以均数标准差表示，检验水准：=0.05。2 结 果2.1 GW9662对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响见表1。GW9662的工作浓度呈0.1、0.5、1、5 mol/L递增时，作用于不同时间的人胃癌SGC-7901细胞，结果示当GW9662浓度为0.5 mol/L 且作用时间在24 h时，其对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制的反转作用达最大值，可以得出其最佳浓度为0.5 mol/L，有效作用时间为24 h。表1 不同浓度的GW9662在不同时间对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响（略）2.2 GW9662对舒林酸抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖作用的影响 MTT测定结果如表2所示。舒林酸对SGC-7901细胞增殖有抑制作用，在各个时间点与阴性对照组相比均具有显著性差异（P<0.01），且其作用具有时间依赖性。经PPAR通路抑制剂GW9662作用后，舒林酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用减弱，细胞的增殖反而较单用舒林酸组增多，具有显著性差异（P<0.01），而且GW9662这种作用在一定范围内呈剂量和浓度依赖性；同时亦可以从表1中看出，当GW9662浓度为0.5 mol/L时，这种翻转舒林酸拮抗肿瘤细胞增殖的作用在24 h时达到高峰，而到48 h其拮抗作用反而下降。表2 不同浓度 GW9662干扰舒林酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖作用的影响（略）2.3 GW9662干预后舒林酸对人胃癌细胞PPAR、Bcl-2、Bax表达的影响见表3。表3 GW9662干预后舒林酸对SGC-7901细胞PPAR、Bcl-2、Bax表达的影响（略） 由表3可见，GW9662干预后，SGC-7901细胞PPAR的表达较单用舒林酸组明显减少（P<0.01）。联合用药组SGC-7901细胞Bax蛋白表达较未用GW9662组下降，而Bcl-2相应上调，差异有统计学意义（P<0.01）。3 讨 论 肿瘤的发生、发展是由于多重突变使细胞的有丝分裂机制激活和凋亡机制失活所致。PPAR是核激素受体超家族中的一员，发现它在多种肿瘤细胞中表达4。目前研究认为，其主要能诱导细胞分化，而细胞的终末分化往往可使细胞停止生长，同时它还可以诱导肿瘤细胞凋亡，PPAR结合配体可以通过凋亡抑制肿瘤的生长，并已经在许多肿瘤细胞株中得到证实5-6。至于其作用机制，研究显示PPAR被激活后可以通过诱导和上调Bcl-2家族蛋白发挥抑制凋亡作用。Bcl-2和Bax同属于Bcl-2蛋白家族，分别具有抑制和促进细胞凋亡功能，在细胞凋亡的调控中发挥重要的调节作用。Bax为Bcl-2相关蛋白，可与抗凋亡蛋白Bcl-2形成异源二聚体，具有抑制Bcl-2而促进细胞凋亡的作用，是细胞凋亡的重要调控基因，Bcl-2与Bax的比值将影响细胞的凋亡。 GW9662是一种有效的、特异性的PPAR抑制剂，本实验采用递增工作浓度的GW9662作用于人胃癌SGC-7901细胞且作用不同时间，发现当GW9662浓度为0.5 mol/L 且作用时间在24 h时，其对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制的翻转作用达最大值，可以得出其最佳浓度为0.5 mol/L，有效作用时间为24 h，因此本实验在进行免疫细胞化学法检测时采用的GW9662浓度为0.5 mol/L。 本实验MTT法结果显示，GW9662浓度在0.5 mol/L以内、在24 h以内随剂量的逐渐增加和作用时间的延长，其抑制舒林酸抗SGC-7901细胞生长的作用逐渐增强。达到0.5 mol/L时，PPAR受体已基本被全部结合，拮抗作用达到顶峰；超过0.5 mol/L后，作用不再增强，反而由于GW9662本身对细胞的毒性，而使细胞增殖抑制率增加。超过24 h后GW9662逐渐失活，对舒林酸的拮抗作用亦逐渐减弱，细胞毒性作用也慢慢消失。Seargent等7亦发现超过饱和剂量的GW9662不但不会促进细胞增殖，反而会出现细胞毒性，导致细胞增殖受到抑制，主要认为有两种可能机制：阻断了细胞上的PPAR受体，细胞不能继续生长；激活了非PPAR通路所致，且认为以后者可能性更大。另有报道认为PPAR激动剂曲格列酮对胃癌细胞亦有抗增殖效应8。而本实验结果显示，PPAR特异性抑制剂GW9662可拮抗NSAIDs的促胃癌细胞凋亡的一部分作用，从而从侧面说明PPAR通路很可能是NSAIDs发挥抗肿瘤作用的一条重要通路。 同时本实验对Bcl-2、Bax进行了免疫组化检测，结果提示GW9662+NSAIDs与单用NSAIDs相比，Bcl-2有所上调，Bax有所下调，说明舒林酸的Bcl-2表达下调及Bax表达上调作用可被GW9662部分阻遏。结合在阴性对照组、GW9662组中Bcl-2高表达、Bax低表达的情况，我们推断PPAR通路参与了NSAIDs诱导胃癌细胞凋亡的机制。 综上所述，GW9662可以部分阻碍舒林酸抑制SGC-7901细胞增殖的作用，抑制其凋亡，其机制可能与启动细胞周期进程有关。GW9662是特异性PPAR抑制剂，从侧面证明了NSAIDs抗肿瘤机制中的COX-2非依赖途径很可能包含PPAR通路，为NSAIDs的临床应用提供更加详尽的理论依据。【参考文献】 1Rahman MA, Dhar DK, Masunaga R, et al. Sulindac and exisulind exhibit a significant antiproliferative effect and induce apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell lines J. Cancer Res,2000, 60(8):2085-2089.2Kim KY, Seol JY, Jeon GA, et al. The combined treatment of aspirin and radiation induces apoptosis by the regulation of bcl-2 and caspase-3 in human cervical cancer cell J. Cancer Lett,2003, 189 (2):157-166. 3Leesnitzer LM, Parks DJ, Bledsoe RK, et al. Functional consequences of cysteine modification in the ligand binding sites of peroxisome proliferator activated receptors by GW9662 J. Biochemistry,2002, 41(21):6640-6650. 4Jackson L, Wahli W, Michalik L, et al. Potential role for peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) in preventing colon cancer J. Gut,2003,52 (9):1317-1322. 5Kawa S, Nikaido T, Unno H, et al. Growth inhibition and differentiation of pancreatic