PTPN22基因多态性与自身免疫甲状腺病的相关性.doc

PTPN22基因多态性与自身免疫甲状腺病的相关性【摘要】 目的: 检测PTPN22基因的单核苷酸多态性（SNP）及其与中国人自身免疫甲状腺病（AITD）的相关性, 并研究CTLA4基因SNP与PTPN22 SNP的相互关系。方法: 采用PCRRFLP技术分析231例AITD患者, 其中Graves病（GD）149例, 桥本甲状腺炎（HT）82例和131例健康对照者PTPN22基因+1858 C>T及CTLA4基因49A>G位点的基因型。采用SASPPCR技术分析PTPN22基因启动子-1123G>C的基因型。结果: （1）PTPN22基因的+1858C>T位点不存在多态性; （2）PTPN22基因-1123G>C SNP的等位基因和基因型分布频率在GD组与正常对照组间的差异有统计学意义（P值分别为0.040和0.013, OR值分别为1.44和2.33）; （3） CTLA4基因 49A>G位点的等位基因和基因型分布频率在AITD组与正常组间有明显差异; （4）与携带PTPN22的G等位基因及CTLA4的AA基因型者相比, 携带PTPN22CC基因型与CTLA4 AG或GG基因型者发生GD的OR值=3.31（95%CI: 2.69-8.89）。结论: PTPN22基因启动子-1123G>C SNP与GD的发生相关, 其CC基因型与CTLA4基因的G 等位基因对GD的发生起协同作用。 【关键词】 蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22基因 自身免疫性甲状腺病 单核苷酸多态性自身免疫性甲状腺病（autoimmune thyroid disease, AITD）是一组以甲状腺为靶器官的自身免疫性疾病, 包括Graves病（Graves disease, GD）、桥本甲状腺炎（Hashimotos thyroiditis, HT）及产后甲状腺炎等。遗传因素在AITD的发病中起重要作用, 目前比较肯定的AITD易感基因有人类白细胞抗原基因（human leucocyte antigen, HLA）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytoxic T lymphocytoassociated antigen4, CTLA4）基因。蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(PTPN22)基因编码淋巴特异性酪氨酸磷酸酶（Lyp）, Lyp是一种细胞内的酪氨酸磷酸酶, 通过其富含脯氨酸的基序（称为P1）与Csk激酶（C末端Src酪氨酸激酶）的SH3结构域相结合, 二者的作用使与T细胞受体（TCR）信号转导有关的激酶如Lck、 Fyn和ZAP70去磷酸化, 发挥抑制T细胞活化的作用1。多个大型、 独立的研究重复了PTPN22基因620密码子的1858C/T SNP与1型糖尿病(T1D)2、 类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）3、 AITD4、 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）5等有相关性, 然而对日本人群RA6、 T1D7以及GD8的大样本相关性分析并未发现PTPN22的1858T SNP。为此, 我们选择了与高加索人AITD的发生有相关性的外显子14+1858 SNP以及与日本人T1D的发生相关的启动子-1123 SNP为研究内容, 观察中国北方汉族人群上述位点是否存在多态性以及与AITD的相关性, 并分析CTLA4基因多态性与PTPN22的关系, 探讨AITD的遗传背景。1 材料和方法1.1 材料 病例组为在西安交通大学第一附属医院内分泌专科门诊收集的231例AITD患者, 平均年龄（36.714.2）岁, 其中GD 149（男40, 女109）例; HT 82（男21, 女61）例。GD和HT的诊断依据为典型的临床表现结合实验室检查。从我院查体中心按AITD患者的年龄分布、 性别构成随机选取131例健康人为对照, 其中男39例, 女92例, 年龄（34.513.3）岁。离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒与PCR扩增试剂盒2 Taq PCR Masterix均购自北京天为时代公司; 限制性内切酶Rsa I购自纽英伦生物技术有限公司; Bbv I购自宝生生物工程有限公司。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。1.2 方法1.2.1 外周血基因组DNA的提取 清晨空腹静脉血EDTA抗凝, 采用离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA, 按说明书操作。1.2.2 PCR扩增反应 （1）PCR扩增PTPN22基因外显子14: 根据GenBank中的PTPN22基因序列自行设计引物, 上游引物为: 5TGG GCT CAA GTG ATC CTC TCA3, 下游引物为: 5ACT GAT AAT GTT GCT TCA ACG GA3。反应体系20 L, 其中2Taq PCR Masterix 10 L, 基因组DNA 1 L, 上下游引物（10 mol/L）各1 L。经94预变性3 min, 94变性30 s, 56退火30 s, 72延伸30 s, 循环30次后72延伸5 min, 150 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。（2） PCR扩增PTPN22启动子: 设计1条共用的上游引物和2条针对3 特异性等位基因的下游引物: 上游引物为: 5ACC CTG CAT ATG TAA TGC TGG T3, 下游引物1: 5CAT TGA GAG GTT ATG CAA GCT C3, 下游引物2: 5CAT TGA GAG GTT ATG CAA GCT G3。用2对引物分别扩增同一标本, 扩增片段长度均为268 bp。反应体系均为20 L, 其中2Taq PCR Masterix 10 L, 基因组DNA 1 L, 上下游引物（10 mol/L）各1 L。引物1退火温度为60 30 s, 引物2退火为62 30 s, 余PCR循环条件同上, 200 g/L的琼脂糖凝胶分析PCR产物。（3）PCR扩增CTLA4的外显子1: 根据文献报道合成引物, 上游引物: 5GAA GGA TGG TGC TTC ACA GAT3, 下游引物: 5CTT TGC AGA AGA CAG GGA TGA3 9。PCR反应体系为20 L: 含2Taq PCR Masterix 10 mL, 上下游引物各1 L, 基因组DNA 1 L。退火温度54 30 s, 余PCR循环条件同上, 150 g/L琼脂糖凝胶分析PCR产物。1.2.3 酶切反应 酶切反应体系均为20 L, PCR扩增产物均为9 L, 分别用Rsa I (10 U/L) 0.5 L酶切PTPN22外显子14, 37水浴过夜; Bbv I（3 U/L） 0.5 L酶切CTLA4外显子1, 65水浴过夜。酶切产物于250 g/L琼脂糖凝胶检测。1.3 统计学处理 读取个体样本, 计算各组基因型频率, 确认其符合HardyWeinberg平衡, 用基因计数法计算各组等位基因频率。采用SPSS11.5软件行统计学处理, 对组间计数资料采用行列表2检验, 对不符合四格表2检验的数据进行Fisher确切概率法分析。OR值(Odds Ratio, 比值比)用Woolf 法。2 结果2.1 PTPN22基因和CTLA4基因的PCRRFLP分析 PTPN22外显子14 PCR扩增片段长度为506 bp, 经Rsa I酶切可得到3种结果: +1858 SNP为CC基因型时酶切产物为300 bp和206 bp2个片段; TT基因型为506 bp1个片段; CT基因型产生506 bp、 300 bp和206 bp3个片段（图1）。图1 PTPN22基因外显子14酶切产物的琼脂糖凝胶电泳（略）Fig 1 The agarose gel electrohhoresis analysis of digested product in PTPN22 gene exon 14M: DNA marker; 1, 2, 4, 5: CC Genetype; 3: CT genetype.CTLA4外显子1的PCR扩增片段长度为652 bp, 经Bbv I酶切可得到3种结果: 49A/G SNP为基因型AA时产生556 bp和96 bp2个片段; 基因型GG产生480 bp、 76 bp和69 bp3个片段; 基因型AG产生556 bp、 480 bp、 96 bp和76 bp4个片段。由于96 bp及76 bp相对分子质量（Mr）小, 电泳只显示556 bp及480 bp（图2）。图2 CTILA4外显子1酶切产物的琼脂糖凝胶电泳（略）Fig 2 The agarose gel electrohhoresis analysis of digested product in CTILA4 gene exon 1M: DNA marker; 1-3: AG Genetype; 4: Control; 5, 6: GG genetype.2.2 PTPN22基因的SASPPCR分析 PTPN22启动子扩增片段的长度为268 bp, 下游引物1针对等位基因G, 下游引物2 针对等位基因C。-1123SNP为GG基因型时下游引物1可扩增出PCR产物; CC基因型时下游引物2可扩增出PCR产物; GC基因型时2对引物均可扩增出PCR产物（图3）。图3 PTPN22基因启动子扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）Fig 3 The agarose gel electrohhoresis analysis of PCR product in CTILA4 gene promoterM: DNA marker; a: Primer 1; b: Primer 2; 1, 5: GC genetype; 2, 3: GG genetype; 4: CC genetype.2.3 各组间各位点的等位基因及基因型分布频率比较 PTPN22基因外显子14+1858C>T位点T等位基因的频率<1%, 说明该基因座在中国北方汉族人群不具有多态性。PTPN22基因启动子-1123G>C SNP在各组内男性和女性之间的等位基因及基因型频率分布无明显差异, C等位基因的分布及CC基因型频率在GD组与正常对照组之间有明显差异而在AITD组、 HT组与正常对照组之间的分布无明显不同（表1）。CTLA4外显子1 49A>G 位点的G等位基因在AITD组、 GD组、 HT组均明显高于正常对照组, 差异有统计学意义; 各病例组与正常对照组基因型分布频率也有显著性差异（表2）。表1 PTPN22基因启动子-1123G>C的等位基因与基因型分布频率（略）Tab 1 Genotypes and alleles frequency of the-1123G>C SNP in PTPN22 gene promoter regionaP<0.05 vs normal group.表2 CTLA4基因外显子1 49A>G的等位基因与基因型分布频率（略）Tab 2 Genotypes and alleles frequency of the 49 A>G SNP in CTLA4 gene exon 1aP<0.05 vs normal group; bP<0.01 vs normal group.2.4 PTPN22和CTLA4基因的相互作用与GD的易感性 PTPN22的CC基因型与CTLA4的AG或GG基因型在增加AITD的易感性方面有协同作用, 与携带PTPN22的G等位基因及CTLA4的AA基因型者相比,携带PTPN22的CC基因型与CTLA4的AG或GG基因型者发生GD的OR值=3.31（表3）。表3 PTPN22基因型和CTLA4基因型相互作用与GD的关系（略）Tab 3 Effect of PTPN22 and CTLA4 genotype on GD3 讨论 目前对PTPN22基因与疾病相关SNP的研究主要针对位点+1858 C>T, 这个位于P1结构域的SNP由编码色氨酸（Trp）的TGG密码子替代了编码精氨酸(Arg)的密码子CGG, 结构上的变异导致了功能缺陷, 免疫沉淀法证实Arg 620可与Csk的SH3结构域结合, 而Trp 620却不能与后者结合, 由此推断Trp 620降低了Lyp下调T细胞活化的作用。在以后的研究中还发现了一种剂量效应关系, 即纯合子个体（1858TT）的Lyp与Csk的结合能力比杂合子个体(1858CT)更低。由此可见PTPN22似乎为TCR信号的转导设置了一个阈值, 当PTPN22与Csk的结合有缺陷时, 对TCR信号转导的抑制作用减弱, T细胞活化的阈值降低, 免疫系统的活性全面增强, 触发了许多潜在的自身免疫反应。但我们的研究未发现+1858T SNP, 这与高加索及北欧等人群中普遍存在此SNP位点且与多种自身免疫病相关的结论不同, 却与先前日本人群的研究结果相似, 说明该基因在亚洲人群中缺少+1858C/T SNP。我们进一步分析了PTPN22启动子-1123G>C位点, 结果提示此位点的SNP与GD的发生相关, 说明除+1858C>T 外, PTPN22基因上存在与AITD相关的其他SNPs。文献报道在高加索人, -1123G>C与+1858C>T两多态性位点之间存在连锁不平衡（D=0.99, r2=0.57, 2=378.8, P=8.510-82）, 由此作者推断-1123G>C与自身免疫病的相关性可能是通过与+1858C>T连锁不平衡而发挥作用的7。我们的研究中未发现这种连锁不平衡, 至于-1123G>C SNP, 目前还不十分明确其对Lyp表达的影响。有人研究此位点周围的DNA序列, 发现-1123G与转录因子激活蛋白4(AP4)的结合位点相匹配, 后者属螺旋环螺旋拉链结构家族, 结合转录因子反义链。-1123G>C位于AP4结合序列的中心基序区域(-1130gcaaGCTGaa-1121)10, 而-1123C等位基因不能与任何已知的转录因子的结合元素相匹配。因此, PTPN22的-1123C可能影响了Lyp的转录效率, 我们推测这可能是-1123G>C多态性与GD呈相关性的原因。 AITD是一种多基因遗传性疾病, 基因之间的相互作用可能影响疾病的发生。我们的研究提示CTLA4基因是AITD的易感基因, 其与PTPN22基因SNP的分布之间无关联, 但两基因均为突变型时增加了GD发生的机会。即说明两基因的变异对疾病的发生起协同作用, 虽然我们的研究不能对这一协同作用的病理生理基础做出解释。 总之, +1858C>T SNP具有种族特异性, 它并不是PTPN22基因上与AITD相关的惟一位点, 我们的研究初步证实该基因启动子的-1123G>C SNP与中国北方汉族人群GD的发生有相关性, PTPN22基因上是否有其他未知的变异或单倍体与AITD相关, 有待于更深入的研究。【参考文献】 1 Mustelin T, Alonso A, Bottini N, et al. 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