乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建.doc

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建 作者：史震，李向阳，周峰，李金龙，尤红娟，汤仁仙【摘要】 目的 为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系，构建HBx基因重组腺病毒载体。方法 应用pAdEasyTM腺病毒载体系统，首先从质粒pCDNA3.l-HBx中酶切得到HBx基因，插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，得到pAdTrack-CMV-HBx，将其Pme酶切线性化后，转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中，通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd-HBx，经Pac酶切线性化后转染人胚肾293细胞，产生重组腺病毒颗粒Ad-HBx。结果 PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad-HBx构建成功，在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论 成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体，为后续研究奠定了基础。 【关键词】 乙型肝炎病毒;HBx基因;腺病毒载体Abstract: Objective To establish a recombinant adenovirus vector carrying HBx gene so as to explore the relationship between HBx gene and the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. Methods By using AdEasyTM adenovirus vector system, a recombined shuttle vector was constructed through the clone of HBx gene into pAdTrack-CMV,then the vector pAdTrack-CMV-HBx was linearized using Pmeand transformed into BJ5183 cell with pAdEasy-1 to generate recombined adenovirus plasmid pAd-HBx through electroporation. Subsequently,the plasmid was linearized with Pacand transfected into 293 cells to pack into recombined adenovirus Ad-HBx. Results PCR, DNA sequence and restriction endonuclease digestion analysis indicated that the recombined adenovirus vector Ad-HBx carrying HBx gene had been successfully constructed. Green fluorescent protein (GFP) was observed under the fluorescent microscope.Conclusion A recombinant adenovirus vector containing HBx gene was successfully constructed and laid basis for subsequent studies.Key words：hepatitis B virus; HBx gene; adenovirus vector原发性肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV) 感染与HCC的发生密切相关，而HBV X基因编码的HBx蛋白在HBV相关性肝癌发生发展中起关键作用1。本实验采用pAdEasyTM重组腺病毒系统，构建HBx基因重组腺病毒载体(Ad-HBx)，为进一步研究 HBx 基因对肝癌发展的影响提供可靠的基因转移工具。1 材料和方法1.1 材料 真核表达载体质粒pCDNA3.l-HBx由本实验室构建并保存2， pAdTrack-CMV腺病毒质粒、含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌、人胚肾293细胞株及空白对照腺病毒Ad由徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心胡书群博士惠赠。Pme酶、Pac酶购自 NEB，其余限制性核酸内切酶及T4DNA 连接酶、PCR试剂盒、质粒DNA回收纯化试剂盒为美国Promega公司产品，Effectence转染试剂盒为德国Qiagene公司产品。1.2 方法1.2.1 pAdTrack-CMV-HBx重组穿梭质粒的构建 用Hind和EcoR双酶切pcDNA3.1-HBx，获取HBx基因，克隆到腺病毒载体pAdTrack-CMV(同样Hind/EcoR双酶切)中。得到重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx。经PCR、酶切验证后送invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司测序。1.2.2 pAdTrack-CMV-HBX与pAdEasy的同源重组 将正确重组的穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx用Pme酶切线性化，电转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183细菌。卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取最小的克隆扩增培养，提纯质粒。用Pac酶切鉴定质粒，鉴定成功的重组子再次转化感受态DH5细菌，筛选阳性克隆并提取纯化，得到含HBx基因的重组腺病毒质粒pAd-HBx。1.2.3 重组腺病毒在293细胞内的包装和扩增 经Pac酶切线性化的重组腺病毒质粒pAd -HBx转染293细胞，按照Effectence转染试剂说明书操作。37、5% CO2培养箱中孵育，2448 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，710天后收集包装细胞，反复冻融4次以收获重组腺病毒Ad-HBx，将病毒冻融上清液反复感染293细胞以大量扩增并收获病毒。1.2.4 重组腺病毒Ad-HBx目的基因鉴定 5 l病毒上清液加上10 l PCR-grade Protease K，55消化1 h，然后煮沸样品5 min，离心后取12 l进行PCR反应，证实重组腺病毒基因组中含有HBx基因。2 结 果2.1 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx的鉴定 用Hind/EcoR酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱以及采用HBx基因全序列的上下游引物其PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱上都可见一条465 bp的条带，与目的基因HBx的DNA片段一致。测序结果也证实重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx中HBx的碱基序列与文献报道一致。2.2 重组腺病毒表达质粒pAd-HBx的鉴定 用Pme酶切线性化pAdTrack-CMV-HBx与pAdEasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，结果得到重组腺病毒载体质粒pAd-HBx。用Pac酶切重组腺病毒表达质粒pAd-HBx，0.8%琼脂糖凝胶电泳显示，有30 kb和3.0 kb的2个条带(图1)，证实穿梭质粒和骨架质粒同源重组成功。2.3 重组腺病毒Ad-HBx的包装 含重组腺病毒的质粒pAd-HBx转染包装细胞293，在2448 h后，荧光显微镜下可观察到GFP的表达(图2)，表明重组腺病毒在293细胞中已开始病毒包装。710天后可观察到细胞病变(CPE)，大部分包装细胞肿胀脱落。2.4 重组腺病毒Ad-HBx的鉴定 PCR鉴定结果证实重组病毒Ad-HBx基因组中含有目的基因，电泳显示465 bp的单一条带(图3)。3 讨 论HBx基因编码的X蛋白是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质直接作用，从而调节基因表达及宿主细胞蛋白质功能，进而影响病毒的复制、宿主细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌变等3。本实验采用限制性内切酶从重组质粒pcDNA3.1-HBx得到HBx基因，应用pAdEasyTM重组腺病毒系统在原核细胞大肠杆菌BJ5183内进行同源重组4， 大大提高了病毒的重组效率。AdEasyTM重组腺病毒系统中腺病毒骨架质粒含有不完整的腺病毒基因，缺失E1区(1-3533)和E3区。E1区为病毒复制所必需，人胚肾细胞293细胞可以补充E1区。重组穿梭质粒含有目的基因HBx基因、CMV启动子、GFP基因、卡那霉素(Kana)耐药基因、限制性内切酶Pac位点和Pme位点。将穿梭质粒用Pme酶切线性化后，电转化至含有骨架质粒的感受态细菌BJ5183中进行同源重组5，利用卡那霉素抗性筛选重组体。重组成功的质粒用Pac线性化，转染293细胞，得到可表达HBx蛋白的重组腺病毒载体。观察其在293细胞中GFP的表达情况，检测HBx蛋白的表达，从而确定重组腺病毒Ad-HBx构建成功。本实验构建的携带HBx基因的重组腺病毒载体，具有转染效率高、易检测观察(GFP为报告基因)的优点，为下一步研究HBx对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程的机制建立基础。【参考文献】 1 Hwang GY, Lin CY, Huang LM,et al. Detection of the hepatitis B virus X protein (HBx) antigen and anti-HBx antibodies in cases of human hepatocellular carcinoma J. J Clin Microbiol，2003，41(12):5598-5603.2 尤红娟,裴冬生,孙伟,等.乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建J. 徐州医学院学报,2006,26(3):191-193.3 汪琼,董俊兴.乙型肝炎病毒X基因及HBx蛋白的研究进展J.生物技术通讯,2006,17(1):78-80.4 Zeng M,Smith SK,Siegel F,et al. AdEasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid