共培养系统在软骨组织工程中的应用和发展.doc

共培养系统在软骨组织工程中的应用和发展张 雨1，刘舒云1，郭维民1，郝春香2，王明杰1，鹿 亮3，卢世璧1，郭全义1(1解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853；2解放军总医院麻醉科，北京市 100853；3安徽省立医院骨二科，安徽省合肥市 230041)引用本文：张雨，刘舒云，郭维民，郝春香，王明杰，鹿亮，卢世璧，郭全义.共培养系统在软骨组织工程中的应用和发展J.中国组织工程研究，2017，21(12):1926-1932.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.021 ORCID: 0000-0002-1390-0919(张雨)文章快速阅读：软骨组织工程中的共培养系统多层次、多维度的成分与结构剖析细胞混合比率生物材料的作用共培养细胞作用模式直接或间接共培养共培养系统共培养系统在软骨组织工程中的研究选择合适生物材料软骨组织工程研究立体培养对细胞的优势平面或三维细胞培养为构建理想的软骨组织工程共培养系统提供导向和理论依据，促进软骨的再生与修复构思、设计全面系统地归纳、总结共培养系统中的各构成组分及培养模式的作用机制及意义最优细胞混合比率文题释义：共培养：模拟机体内生理条件，将两种(可来自同一组织或不同的组织)及以上的细胞混合共同培养，从而体外再次仿生构建体内微环境，促进其中一种或多种细胞的形态和功能维持在机体内的稳定表达状态，并持续较长久的时间。组织工程：应用生命科学与工程科学的原理和技术，在正确认识生物体有机体的正常及病理状态下的组织结构与功能关系的基础上，应用生物支架、活细胞及细胞因子等构建组织工程组织，用于修复和促进机体各种组织或器官损伤后的功能与形态的再生。摘要背景：近年来大量的研究证明，共培养应用到软骨组织工程中能够成功构建具有更好生物学特性的组织工程软骨。目的：通过对共培养概念的提出及共培养系统中种子细胞来源、细胞混合比率、共培养空间模式及生物材料各方面分别进行整理和深入阐述，归纳分析各因素对组织工程软骨生物学特性的效应，展望未来共培养系统在组织工程软骨研究中的发展方向。方法：第一作者检索1976年1月至2016年5月PubMed数据库、Web of Science数据库和中国知网中的相关文献，检索关键词为“Co-culture，Co-culture systems；articular cartilage，chondrocytes，mesenchymal stem cells； tissue engineering，articular cartilage tissue engineering；共培养，共培养系统；关节软骨，软骨细胞，间充质干细胞；组织工程，软骨组织工程”。最后纳入文献共计60篇，中文1篇，英文59篇。结果与结论：共培养强调了细胞处理过程中生物微环境的重要性，即在体外为细胞生长提供物理-化学-生物三位一体的刺激因素；在软骨组织工程中，共培养很好地维持了软骨细胞的活性和天然细胞表型，能够诱导具有多项分化潜能的间充质干细胞分化成软骨。另外，为软骨组织工程软骨细胞的来源受限问题和骨软骨复合伤的治疗带来新的途径；但是共培养中细胞间相互作用的具体机制仍然有待进一步研究，从而为优化共培养系统培养条件提供有力依据，以更好地应用到软骨组织工程中构建优良的组织工程软骨组织。关键词：张雨，男，1988年生，安徽省蒙城县人，汉族，解放军总医院骨科在读硕士，主要从事关节软骨的组织工程修复与再生、干细胞生物微环境方面的研究。通讯作者：郭全义，主任医师，副教授，硕士生导师，解放军总医院骨科研究所，北京市 100853 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2017)12-01926-07稿件接受：2016-12-01Zhang Yu, Studying for masters degree, Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, the Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopaedics, the PLA Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, Beijing 100853, ChinaCorresponding author: Guo Quan-yi, Chief physician, Associate professor, Masters supervisor, Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, the Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopaedics, the PLA Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, Beijing 100853, China组织构建；软骨组织工程；共培养；软骨细胞；间充质干细胞；生物材料；软骨组织工程；国家自然科学基金主题词：软骨细胞；间充质干细胞；生物相容性材料；组织工程基金资助：国家自然科学基金资助项目(81472092)；国家高技术发展研究计划(863计划)资助项目(2015AA020303)Application and progress of co-culture systems in cartilage tissue engineering Zhang Yu1, Liu Shu-yun1, Guo Wei-min1, Hao Chun-xiang2, Wang Ming-jie1, Lu Liang3, Lu Shi-bi1, Guo Quan-yi1 (1Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, the Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopaedics, the PLA Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, Beijing 100853, China; 2Department of Anesthesiology, the General Hospital Of Chinese PLA, Beijing 100853, China; 3Second Department of Orthopaedics, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230041, Anhui Province, China)AbstractBACKGROUND: Accumulative evidence supports that co-culture technology can be applied to construct the tissue-engineered cartilage with excellent biological characters.OBJECTIVE: To elaborate the co-culture concept and conclude and analyze seed cell sources, cell mixed ratio, spatially-defined co-culture models and biomaterials in co-culture systems to conclude and analyze the biological characters of tissue-engineered cartilage, and to prospect progression of co-culture systems in cartilage tissue engineering. METHODS: The first author retrieved the databases of PubMed, Web of Science, and CNKI for relative papers published from January 1976 to May 2016 using the keywords of “co-culture, co-culture systems; articular cartilage, chondrocytes, mesenchymal stem cells; tissue engineering, articular cartilage tissue engineering” in English and Chinese, respectively. Finally 60 literatures were included in result analysis, including 1 Chinese and 59 English articles.RESULTS AND CONCLUSION: Co-culture technology emphasizes the role of microenvironment in terms of various physical, chemical and biological factors in the cell processing. In cartilage tissue engineering, co-culture systems contribute to maintain the viability and natural cell phenotype of chondrocytes and induce cartilage differentiation of mesenchymal stem cells. In addition, co-culture technology provides a novel way for cartilage tissue engineering to overcome the shortage of chondrocytes and repair injury to the cartilage-subchondral bone. However, the mechanisms of cell-cell interaction in co-culture systems still need to be explored in depth, so as to optimize the co-culturing conditions and construct perfect tissue-engineered cartilage.Subject headings: Chondrocytes; Mesenchymal Stem Cells; Biocompatible Materials; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81472092; the National High-Tech Research & Development Program of China (863 Program), No. 2015AA020303Cite this article: Zhang Y, Liu SY, Guo WM, Hao CX, Wang MJ, Lu L, Lu SB, Guo QY. Application and progress of co-culture systems in cartilage tissue engineering. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(12):1926-1932.0 引言 Introduction 从生命体中获取目的组织或细胞，在体外环境对其进行不同方面的研究和处理后，最终是要把研究的成果回归到生命体内，为进行正常生命活动所服务，这是生命科学对生命体的探索常常需要经历的过程之一。因此，怎么能够保证从机体内取出目的组织或细胞在接受条件性刺激后，都作出在机体内外一致的反应或是最大可能接近是非常重要的，是科研结果的真实性、可靠性的具体体现。然而，对于主流的研究对象细胞，目前一般的体外细胞处理技术单种细胞平面培养，只是简单的为细胞的生长提供必需的物理、化学条件，包括温度、pH、生长营养因子等。大量的研究证实，仅仅提供这些条件尚未能满足细胞维持正常生长的需求1-2。特别是在软骨组织工程中，从正常软骨组织中分离得到的软骨细胞在这些简单的理化条件下扩增培养后极易发生去分化，表现在细胞形态、蛋白合成和基因表达方面的变化3-4，最终，导致构建的组织工程软骨的生物学特性难以达到与天然软骨组织相匹配的结果。表现为以纤维软骨替代透明软骨来修复软骨损伤，修复区力学强度难以达到正常需求。间充质干细胞由于其具有多向分化的潜能，而被广泛的应用于组织工程。但是，在经历体外的诱导分化成软骨过程中，常常因诱导分化不足或过度而导致细胞肥大或钙化软骨的出现5。这些均困扰着组织工程软骨的发展和应用。文章归纳分析各因素对组织工程软骨生物学特性的效应，展望未来共培养系统在组织工程软骨研究中的发展方向。1 资料和方法 Data and methods1.1 检索方法 由第一作者于2016年5月进行检索，检索文献时限为1976年1月至2016年5月，以检索词“Co-culture, Co-culture systems; articular cartilage, chondrocytes, mesenchymal stem cells; tissue engineering, articular cartilage tissue engineering; 共培养，共培养系统，关节软骨，软骨细胞，间充质干细胞；组织工程，软骨组织工程”，在PubMed数据库(/pubmed/)、Web of Science数据库和中国知网(/)中检索所有研究原著文献。1.2 纳入标准 文章所述内容需为软骨细胞共培养的实验研究；共培养研究属于软骨组织工程方面，包括修复软骨损伤的体内动物实验研究。1.3 排除标准 符合纳入标准的综述文献；重复性研究。1.4 数据的提取 计算机初检得到中英文文献共计300余篇，阅读标题和摘要进行初筛，排除综述，中英文文献重复报道，以及与软骨细胞共培养不相关的文献。1.5 质量评估 符合纳入标准的中英文文献共计60篇(英文文献59篇，中文文献1篇)，涵盖了共培养系统在软骨组织工程中的应用，研究内容包括种子细胞的来源、细胞的混合比率、直接共培养或间接共培养、共培养体系中的生物材料应用及共培养的平面或三维细胞培养模式。文献检索流程图见图1。2 结果 Results2.1 共培养概念的提出及在软骨组织工程中的研究 近些年来，已经有报道细胞间的信号在细胞的生物学行为中发挥着重要的作用6。在体内，细胞的新陈代谢和功能的第一作者以“Co-culture，Co-culture systems；articular cartilage，chondrocytes，mesenchymal stem cells；tissue engineering，articular cartilage tissue engineering；共培养，共培养系统；关节软骨，软骨细胞，间充质干细胞；组织工程，软骨组织工程”检索PubMed，Web of Science和CNKI数据库排除重复研究共检索到中英文文献300余篇纳入有关与软骨细胞共培养、软骨组织工程中共培养相关的实验研究平面或三维培养模式生物材料的添加不同直接或间接共培养细胞的混合比率不同种子细胞的来源不同通过阅读摘要初步筛选，共选取51篇文献进行综述，其中中文17篇，英文34篇，涵盖以下具体内容：图1 共培养系统在软骨组织工程中的相关研究综述文献检索流程图发挥时刻受到来自微环境的信息调控，包括来自周围细胞、细胞外基质或因子中的生化信息、生物力学和生物电刺激信号等7-8。当细胞脱离机体内环境，通过分离、消化及纯化在体外环境单种培养时，导致细胞失去了天然细胞微环境的作用，其相应的天然生物学特性也因此而丢失。在共培养系统中，能够为种子细胞提供所需的物理条件、化学营养物质的同时，通过加入一种或以上的种子细胞来提供相应的生物刺激信息，模拟体内生物微环境，以维持细胞的正常代谢和功能9。在许多领域研究证实细胞间相互作用影响着细胞结构、细胞极性、细胞增殖和生化功能10-11。软骨组织工程中，相对于单种细胞培养，共培养系统通过构建的仿生体内微环境表现出其独特的优势。一方面，陪伴细胞(如间充质干细胞)通过分泌营养因子或细胞间的信息交流促进软骨细胞增殖和延迟去分化12。同时，软骨细胞能够诱导具有多项分化潜能的间充质干细胞分化成软骨13。另一方面，共培养降低了软骨组织工程中软骨细胞的需求量，减少了体外扩增培养时间，尽可能的降低了软骨细胞原始表型的丢失。然而，共培养系统是复杂的，其作用机制尚不是非常清楚，存在争议。因此，更好的理解共培养作用机制对于优化软骨组织工程共培养系统，增强组织工程软骨生物学特性是十分必要的。共培养技术的基本方法是应用两种及以上的种子细胞或材料的共同培养，通过不同种细胞分泌不同细胞因子、细胞间信息交流及细胞与细胞外基质的相互作用，最终目的是达到一个天然的协同作用使他们之间形成优势互补，劣势消除的理想效果。经过近40年的发展，在软骨组织工程领域的共培养已经取得了令人满意的成就。但是，不同的共培养系统常常会得到不同甚至相反的结论。有学者报道认为在软骨细胞与间充质干细胞共培养，可以通过营养作用刺激软骨细胞增殖促进新生软骨形成，而间充质干细胞本身并没有诱导分化成软骨14。另外，间充质干细胞能够通过分泌细胞因子和生长因子发挥抗炎和免疫调节作用，提供合适的微环境提高软骨细胞的细胞活性。然而，Acharya等15的研究结果中发现，间充质干细胞促进软骨细胞增殖的同时，发现其也发生了成软骨分化，表现为软骨相关基因表达水平上调和蛋白的高合成。导致研究结果层次不齐，甚至相矛盾的原因可能是多方面的，包括共培养系统中种子细胞的来源不同，如表型最原始的原代软骨细胞、已经发生去分化的软骨细胞或不同组织来源的间充质干细胞等。另外，也可能由于共培养条件的差异所致，如三维立体共培养或平面共培养、直接混合共培养或间接共培养、种子细胞比率及生物材料的不同等均是影响实验结果的影响因素之一。2.2 软骨组织工程共培养系统中各成分的分析2.2.1 种子细胞的来源 种子细胞是组织工程中最为重要的组成成分，其生物学状态的好与坏对组织工程的结果起到决定性作用。在软骨组织工程中，种子细胞的来源主要包括实质细胞和间充质干细胞。实质细胞主要包括原代软骨细胞、传代后的软骨细胞、骨关节炎软骨细胞和软骨下骨细胞。间充质干细胞主要来源于骨髓血、滑膜组织、脂肪组织、脐带及脐带血等组织。间充质干细胞：间充质干细胞被广泛应用到软骨组织工程共培养系统中与软骨细胞共培养，主要体现以下优 势1，16：来源广泛且为永生细胞；具有自我更新和多系分化潜能；免疫调节功能和低的免疫原性等。这些特性在体内组织的再生与修复中扮演着重要的角色。不同组织来源的间充质干细胞在共培养系统的应用即有其独特的优势，也面临着一些挑战。在共培养系统中，骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养，骨髓间充质干细胞通过营养作用促进软骨细胞的增殖，延迟软骨细胞的去分化17-18。Ouyang等19发现和软骨细胞共培养的骨髓单个核细胞也能够延迟软骨细胞的去分化。相对于骨髓干细胞，脂肪间充质干细胞有类似的分化成软骨潜能和克隆增殖能力15。另外，脂肪间充质干细胞可以一次获得大量的细胞数，而不需经过体外扩增的优势，有利于临床转化和应用。相比较其他组织来源的间充质干细胞，据报道滑膜间充质干细胞具有更优越的增殖活性及分化成软骨潜能。Zhang等20应用滑膜间充质干细胞与经过转化生长因子3转染的软骨细胞在藻酸盐水凝胶中共培养，发现不仅诱导滑膜干细胞分化成软骨，而且很好的维持了软骨细胞的天然表型。但是，诱导成软骨的滑膜间充质干细胞仍然保持着自身的成纤维细胞特性，这需要未来的研究进一步评估其在共培养系统中的应用价值。胚胎间充质干细胞是最原始的干细胞，可被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。人胚胎干细胞拥有较高的端粒酶活性，具有很强的长期增殖潜能和定向分化能力。Vats等21首次报道人胚胎干细胞与软骨细胞共培养后被诱导分化成软骨细胞。与单纯人胚胎干细胞的培养组相比，共培养系统中的人胚胎干细胞能够分泌更多的细胞外基质，如糖胺多糖及型胶原等。由于来源于骨髓、滑膜及脂肪组织的间充质干细胞会给患者带来二次损伤，且细胞的活性受到患者自身体质的影响，而来源于胚胎组织的胚胎干细胞数量受限又带来伦理争议等，这些也一定程度的影响了它们的推广和应用。来源于围产期组织的间充质干细胞，在一定程度上解决了以上问题而成为当前研究的热点。Pereira等22用人脐带间充质干细胞与人关节软骨细胞以微球方式共培养，发现人脐带间充质干细胞能够诱导分化成软骨，获得较满意的组织工程软骨。另外，围产期组织来源的广泛，对人体不会造成伤害，又不受伦理约束，其被认为是介于胚胎干与成体间充质干细胞之间的年轻有活力的种子细胞23-24，因此其有望成为未来该领域具有应用前景的种子细胞之一。实质细胞：共培养技术已经被尝试用于解决单纯的软骨损伤和骨软骨复合伤的问题中，如骨关节炎和软骨-软骨下骨复合损伤等。在骨关节炎中，软骨细胞一定程度上失去了原有的表型而发生了去分化。相对于原代软骨细胞，发生去分化的软骨细胞其细胞表面标志物已经发生了很大的改变，包括整合蛋白、合成代谢调节因子等25-28。原代软骨细胞与去分化的软骨细胞共培养，可以逆转去分化的软骨细胞反分化29。这说明，临床中可以保留损伤或退变的软骨组织或细胞与原代软骨细胞共培养，用来修复损伤软骨组织。这不仅充分利用了损伤的软骨组织，而且也很大程度上减少了对正常软骨组织的需求。由于共培养系统具有多种细胞共同在同一环境培养的独特优势，而骨软骨复合伤以多种组织多种细胞的同时受损为特点，所以近年来，共培养技术应用于骨软骨复合伤修复的探索也成为研究的热点之一30-33，希望能为骨软骨复合伤带来有效的修复效果。Jiang等34研究称，在软骨细胞与成骨细胞的共培养系统中发现，相对于单纯软骨细胞培养组，共培养组的软骨细胞外基质糖胺聚糖明显合成降低。另外，在单纯成骨细胞培养组中，成骨细胞的钙化程度更高。这一研究结果也许可以为骨软骨过渡区的再生提供有效解决途径。2.2.2 共培养细胞混合比率 在共培养系统中软骨细胞与间充质干细胞的混合比率，可能会通过影响细胞因子的分泌量而影响共培养细胞的细胞行为，如间充质干细胞的成软骨分化5。随着软骨细胞比率的增加，型胶原mRNA 的表达水平也显著提高23。相反，提高间充质干细胞的比率会导致型和型胶原mRNA的表达水平上调18，35。因此，选择最佳的种子细胞混合共培养比率，使共培养结果向着需要的方向发展显得更为重要。Mo等36报道，间充质干细胞与软骨细胞共培养的混合比率通过细胞间相互作用影响着细胞的分化和功能。随着间充质干细胞与软骨细胞共培养时间的延长，软骨细胞样外基质的合成增加，同时型胶原基因的表达水平上调。Qing等35报道了用兔软骨细胞与骨髓干细胞以21的比率混合共培养为最佳比率，认为软骨细胞分泌的转化生长因子、骨形态发生蛋白及胰岛样生长因子1在促进骨髓干细胞成软骨方面起到重要作用。Sabatino等28研究得出体内与体外最佳的种子细胞混合共培养比例不同，在体内最佳混合共培养比率中间充质干细胞所占比率更高于体外，猜测这可能与间充质干细胞在体内创造了一个成软骨诱导的微环境有关。共培养系统中，细胞混合比率在细胞间相互作用中扮演着重要的角色，影响间充质干细胞的分化和软骨样细胞外基质的分泌。由于种子细胞的活性、来源不同和培养环境的不同，导致最佳混合培养比率的不同。具有稳定的天然软骨细胞表型和细胞活性，有助于降低共培养系统中软骨细胞所占的比率和间充质干细胞的分化成软骨。未来的研究应该聚焦在减少软骨细胞的比率，提高间充质干细胞的比率，同时获得满意的新生软骨组织。2.2.3 直接或间接共培养 直接共培养或间接共培养直接影响着共培养细胞的细胞间相互作用模式(图2)，包括细胞-细胞间隙连接、细胞-细胞外基质、细胞-细胞因子或者它们之间联合模式。细胞间相互作用的模式也许影响着软骨细胞表型的维持和成软骨诱导的作用。间接共培养是机械地把共培养细胞在物理空间上分离，如Transwell小室10，单独研究细胞分泌的细胞因子对另一种细胞生物学行为的作用。直接共培养是把共培养细胞相互均匀混合在一块，除了细胞因子对细胞产生作用外，还会通过细胞表面分子受体，细胞分泌的细胞外基质等方式参与到细胞间的相互作用中37。间接共培养强调软骨细胞或间充质干细胞分泌因子对共培养细胞增殖、细胞外基质分泌和成软骨分化发挥重要作用。并且已经有报道称，在间接共培养系统中没有异种细胞间物理接触的前提下，检测到了软骨细胞分泌相关细胞因子，并成功的诱导了间充质干细胞分化成软骨38-40。然而，有研究称细胞间的物理接触也许扮演着主导作用41-42，单独的依靠细胞分泌的细胞因子不能或极小程度的改变间充质干细胞成软骨基因的上调。通过整合蛋白、生长因子和细胞因子实现近距离的细胞间交流和信号传递发挥的作用不可忽视43-44。应用微球形式共培养的研究中发现，下调了间充质干细胞的X胶图2 种子细胞共培养模式图图注：图a为平面种子细胞直接共培养；b为平面种子细胞间接共培养；c为种子细胞混合三维直接共培养；d为种子细胞混合三维间接共培养。原基因表达水平而降低其表型肥大，同时维持软骨细胞表型15，45。2.2.4 生物材料 除了种子细胞外，生物材料也构成了共培养系统的重要组成部分之一。生物材料的拓扑结构、力学特性和表面功能基团都独立地影响着细胞表型、增殖和分化，以及新生组织的结构等46-48。应用到软骨组织工程共培养系统的材料很多，主要包括合成材料(如聚己内酯17)、天然高分子材料(如藻酸盐水凝胶15、琼脂49、胶原等28)和它们的复合材料(如聚己内酯/胶原、聚己内酯/细胞外基质等)50。软骨细胞与间充质干细胞在透明质酸水凝胶中共培养，发现增强了间充质干细胞的成软骨分化，但是减低了软骨细胞的活性导致新生组织的力学和生化特性与对照组并未见明显差异45。Mo等36报道人间充质干细胞与兔关节软骨细胞在藻酸盐中以 21混合共培养，发现人间充质干细胞表现为成骨表型，认为可能是藻酸盐水凝胶更有助于间充质干细胞向骨分化。Levorson等51报道，相比较单独应用聚己内酯作为共培养种子细胞的支架材料，复合有细胞外基质的聚己内酯支架更能上调间充质干细胞胶原基因的表达水平。由于在共培养系统中有多种细胞的同时存在，因此应考虑到同一材料会给不同种子细胞带来的不同生物学影响。选择合适的生物材料同时适合多种细胞的生长和代谢，为细胞间相互作用提供最佳的微环境，对达到满意的共培养效果显得至关重要。2.2.5 平面或三维共培养 大量研究表明，平面培养会加快软骨细胞的去分化，三维立体培养能够较好的维持软骨细胞的天然表型52-54。而在共培养系统中，软骨细胞的表型直接影响着软骨细胞与其他细胞的相互作用。在三维共培养系统中(图2c，d)，微球和多孔支架是最长用的空间培养模式55-57。细胞自聚集微球会随着微球的逐渐增大而导致氧气和营养物质难以渗透至组织内部，同时代谢产物也难以排出组织，因此限制了组织的再生能力58。而多孔支架在为种子细胞提供空间结构的同时，材料本身可以促进种子细胞的黏附、增殖和细胞外基质的分泌，随着支架的降解让出种子细胞生长的空间，是一个持续动态的再生过程。三维立体共培养是未来共培养具有希望的培养模式之一。2.2.6 其他可能的影响因素 培养基对细胞生物学行为可能产生的影响，由于考虑到干细胞具有高细胞活性、增殖快和多系分化潜能，而软骨细胞体外扩增培养易发生去分化改变等，探索共培养对细胞生物学行为的影响，更好地构建共培养组织工程组织，部分学者通过应用不同的血清浓度或在共培养培养基中添加相应细胞因子如转化生长因子1和地塞米松等59-60，或通过基因导入目的细胞中使其持续表达相应细胞因子，如转化生长因子。结果证实，共培养能够增强细胞对细胞因子的敏感性，提高了目的基因及蛋白的表达水平，高浓度血清可增强软骨细胞对干细胞的诱导作用。另外，有研究表明，在生物反应器中进行动态的软骨细胞培养，会通过流体静水压给予软骨细胞力学刺激的作用，从而增强了软骨细胞表型的维持和细胞外基质成分的分泌。因此，如果在共培养系统中添加仿生软骨功能状态下的力学刺激调剂，可能会得到较为理想的结果。但是，目前尚缺乏此类共培养的相关研究，应该是未来探索的方向之一。3 结论与展望 Conclusion and prospect 共培养的初衷是在体外环境下模拟体内细胞微环境，促进细胞间信息交换和功能仿生组织的生成。共培养为软骨组织工程中的基础研究与临床应用遇到的瓶颈，包括软骨细胞来源受限及体外扩增去分化、间充质干细胞的诱导分化发生肥大和骨软骨一体化再生问题等，提供的新的解决途径，并取得了系列的进展。但是，软骨组织工程共培养系统中细胞间相互作用的具体机制仍不清楚，距离临床应用还有很大的距离。理解细胞间相互作用的具体机制将有助于对共培养条件的优化，如种子细胞的来源、混合培养的比率、细胞间的交流模式和生物材料的选择。共培养条件的探索和细胞间相互作用的机制仍然是未来研究的重要内容。另外，目前的共培养的相关研究多局限于体外，动物体内实验应该加以开展来进一步验证共培养的优势。 致谢：感谢解放军总医院医学图书馆提供相关数据库，以方便进行相关文献的检索。作者贡献：第一作者构思并设计综述，第二、三作者参与分析并解析数据并起草，其余作者审校。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：无涉及伦理冲突的内容。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：通讯作者郭全义对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名- 非商业性使用- 相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References 1 Filardo G, Perdisa F, Roffi A, et al.Stem cells in articular cartilage regeneration. 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