微透析技术及其应用进展.doc

微透析技术及其应用进展【关键词】 微透析；,回收率；,应用摘要：该文介绍了微透析取样技术的原理，组成以及微透析探针的类型，对常用测定微透析探针回收率方法的优点缺点进行了比较，综述了近年来国内外有关微透析技术的应用进展，显示该项技术在研究领域具有广阔的应用前景。关键词：微透析； 回收率； 应用微透析(microdialysis) 技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种新型生物采样技术, 可在麻醉或清醒的生物体上使用, 特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。目前已成为实验神经生理学和神经化学的重要研究工具之一, 它可提供递质释放、摄取和代谢的必要信息。随着微透析采样和检测灵敏度的不断提高, 微透析技术迅速发展起来, 成为生物化学研究中一个引人注目的新领域。从20世纪90 年代起这项技术在生命科学研究中进入高潮。微透析取样装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备1组成。微量泵以注射泵为佳,有利于减少恒流泵和蠕动泵的波动, 流速一般为15 l/min。微透析探头有直线性探头、环形探头、同心型探头等不同的类型(微透析管因实验对象不同而形状大小各异)；按照探头的形状分为穿颅探头、U型探头、I型探头、环形探头等（图1）。目前普遍应用的是同心型探头，微透析探头通常是由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道； 长度一般为110 cm。半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成（图2）, 载留分子量510 KD不等。实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的微透析探头。图1 探头类型（略） 图2 微透析探针（略）微透析主要原理是以透析原理作为基础,通过对插入生物体内中的微透析探头在非平衡条件下进行灌流,物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内,并被透析管内连续流动的灌流液不断带出,从而达到活体组织取样的目的。微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体( in vivo)、实时( real time) 和在线(on line) 取样, 特别适用于研究生命过程的动态变化。微透析技术的优点是活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。该技术的另一大优点是样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行。此外微透析技术的独到之处是可以单独取得细胞外液, 因此可对体内神经递质的释放量进行动态监测, 具有重要的生物学意义。在国外已成功地用于测定细胞外液中的多种神经递质2、氨基酸3、葡萄糖4、腺苷及其代谢产物5等小分子化合物。然而微透析技术一直困扰人们的问题就是如何对取出的样品进行准确可靠的校正，这就涉及到对探针的回收率的测定。探针回收率是指从灌流液中流出的待测组分与标准浓度之比的百分数。探针回收率是影响微透析结果的重要因素, 取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质(材料、孔径、长度及几何形状等)、待测物质的分子量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等。目前测定回收率的方法主要有以下几种：1 外标法只需要计算被测物质相对浓度的变化时, 可简单地采用体外回收率法。测定宜在取样后立即进行, 将探针放入已知浓度的标准溶液中, 用与体内实验相同的流速灌流探针。达到稳定状态后收集灌流液并进行检测。测定浓度与标准溶液浓度之比就是体外回收率。此法虽简单易行, 但由于被测物质在体外时与体内的环境状况不同, 检测结果不能严格地等同于实际的回收率。2 内标法6是往灌流液中加入已知浓度且性质与被分析物质相似的另一种物质做内标,内标物不仅在扩散性质上与被分析物一致,而且还要在体内的代谢过程中也尽可能一致,测出透析率即作为被分析物的回收率。由于选择内标的局限性很大, 限制了此法的应用。3 反透析法7假设被测物从两个方向通过半透膜是同等的。在灌流液中加入一定浓度的内标物(Cic) ,在与体内透析相同的条件下操作, 测定透析液中内标物的浓度(Cec) ,体内回收率(Rin ,vivo ) 可用下式计算：Rin vivo = (1 Cec/ Cic) 100 %本法要求内标物具有生物惰性, 尽可能与被测物相似。4 低流速法8低流速法是将灌流速度尽量降低, 一般控制在50 nl/min 以下, 使回收率尽量达到100% , 此时便无需进行回收率校正了。此法取样体积很少(一般在5 l以下) , 不但对仪器的检测灵敏度要求极高, 而且取样时间长易造成样品的挥发或氧化。此外还有外推至零流速法(extrapolation to zero flow)9和零净通量法(zero - net flux)10。微透析只是一项取样技术，要进行体内物质测定必须要与分析仪器联用，以便于有利于对微量样品进行实时和在线分析测定，减少操作误差。微透析时选取适当微透析膜的截留分子量, 免除了复杂的样品前处理及由此而产生的样品损失和误差, 也不会因在室温取样而酶解, 提高了样品的稳定性,使微透析液中可不含蛋白质和酶等生物大分子, 同时由于微透析取出的样品体积小，约为l级，易于挥发，因此取出后不易久放，能直接进入分析仪器进行测定。常用的有高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电泳(CE) 、质谱（MS）及激光诱导的荧光检测器等,可从容地进行分离和测定。利用微透析技术进行动物实验主要是在被限制动物或麻醉动物身上，也可用于自由活动的清醒动物，应用最多的脑功能的研究，近年来该技术的应用已取得很多的科研成果。脑：在颅内手术，Hutchinson等11利用微透析方法与其他监测手段研究动脉瘤手术的情况,得出:患者稳定期脑氧压2.06.0kPa(1545 mmHg)之间；葡萄糖含量在0.53 mmol/L之间,乳酸/丙酮酸比值30，在3265之间则暗示有厌氧代谢,3 min的短暂夹闭不会引起脑氧量减少或乳酸/葡萄糖比值的升高；长时间夹闭则会有副作用。万登峰12等应用微透析技术动态收集大鼠轻、重度脑损伤局部的细胞外液(ECF)透析液,观察其葡萄糖含量(Glud)和乳酸含量(Lacd)变化。透析管插入引起Glud和 Lacd的变化很小(P0.05)；脑损伤后Glud下降，与对照组及损伤前相比相差显著(P0.05)，且损伤越重其变化越显著(P0.05)；而脑损伤后Lacd 则上升，与对照组及损伤前相比相差显著(P0.05)，且损伤越重其变化亦越显著(P0.05)；脑损伤后Glud和 Lacd的变化分别与脑组织含水量呈显著负相关(P0.05)和显著正相关(P0.05)。皮肤：Sjogren等13选用聚乙烯砜膜(100 kD) 探针测定皮肤在探针插入这一微创条件下白介素- 6的产生,为测定复杂的细胞因子系统提供了技术参考。金属离子与一些皮肤病的发病有关,但活体皮肤离子浓度测定一直较难实施,Leveque等14以该技术联用原子吸收光度计测定真皮铁离子浓度,证实微透析可用于皮肤离子测定。此外还可进行血液、脂肪、肌肉中药物浓度的变化。由于物质跨膜扩散是双向性的，微透析技术除了可用于监测体内环境的生化改变外,还可作为一种给药途径。可将药物缓慢、直接地作用于靶器官，提高药效分析和药物代谢动力学研究的水平，特别是局部直接给药更能显示出这种方法的优越性。阳晓等15研究发现，在实验性大鼠的腹透液中加入川芎嗪长期进行腹膜透析(PD)，腹膜间皮细胞结构基本完好,间皮下无明显的基质沉积，且大鼠PD的超滤量显著提高，小分子物质的清除率增加,而对透出液中蛋白质浓度则无明显影响。微透析技术已用于测定直接人脑实质的药物浓度16，并可帮助诸如爱滋病毒（HIV）感染病人选择合适的穿透血脑屏障的药物。但微透析技术仍存在一些不足，微透析技术的不足之处在于探针的植入会造成局部轻微的损伤。特别是对急性实验可能有一定程度的影响。回收率的测定虽然种类繁多, 但每种方法都不够完善, 影响了实际浓度的计算。由于采用的方法不同在检测浓度极低的生理活性物质时不同作者的报告有时可能相差近一个数量级。微透析技术要求探头必须准确插在同一取样部位, 因此不适合对很小的脑内神经核团采样。由于透析膜体积小, 灌流液的流速低(一般1 5 l/min),很难进行以秒为单位的动态观察。参考文献：1 只达石，黄慧玲.微透析技术系统在神经科学中的应用J.生物医学工程与临床，2005，9(1):56.2 Marise Parent,David Bush,Gail Rauw, et al.Analysis of Amino Acids and Cstecholamines,5-Hydroxytryptamine and Their Matabolites in Brain Areas in the Rat Using in vivo MicridialysisJ.Methods,2001,23:11.3 O,Shea TJ ,Weber PL ,Bammel BP, et al . Monitoring excitatory amino acid release in vivo by microdialysis with capillary electrophoresis electrochemistryJ.J Chromatogr , 1992 ,608 (12) :189.4 Kaptein WA , Zwaagstra JJ , Venema K, et al . Continuous ultraslow microdialysis and ultrafiltration for subcutaneous sampling as demonstrated by glucose and lactate measurements in ratJ.And Chem,1998,70(22):4696.5 Hada J , Kaku T, Morimoto K, et al . Activation of adenosine A2 receptors enhances high K( + ) - evoked taurine release from rat hippocampus : a microdialysis studyJ. Amino Acid ,1998 ,15 (12) :43.6 Larsson CI. The use of aninternal standardfor control of the recovery in microdialysisJ.Life Sci ,1991 ,49 :PL 93.7 Wang Y , Wong SL , Sawchuk RJ . Comparision of in vivo and in vitro calibration of microdialusis probes using retrodialysisJ. 1991 ;10 :87.8 M enacherry S, Hubert W. Justice J B T r. 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