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173生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11 -葡萄糖苷酶基因工程菌发酵工艺优化 刘长江 1，梁 爽1，郑 艳1，宗绪岩1，李长彪2 (1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161； 2.抚顺市农村经济委员会，辽宁 抚顺 113000) 摘 要：以菌体生物量和酶比活力为参考指标，通过单因素和响应面分析法优化-葡萄糖苷酶基因工程菌发酵条 件，得到最优的发酵条件：温度 37.9、pH6.6、接种量 10%、转速 200r/min、诱导时间 10h，在此条件下发 酵可以使-葡萄糖苷酶酶活力达到147.8U/L。 关键词：-葡萄糖苷酶；基因工程；发酵工艺 -Glucosidase Production under Optimized Fermentation Conditions of Genetically Engineered Bacterial Strain LIU Chang-jiang1，LIANG Shuang1，ZHENG Yan1，ZONG Xu-yan1，LI Chang-biao2 (1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China ； 2. Committee of Rural Economy of Fushun, Fushun 113000, China) Abstract ： The fermentation conditions of genetically engineered bacterial strain for -glucosidase production were optimized using one-factor-at-a-time method and response surface analysis based on central composite design. The optimal procedure for -glucosidase production was based on 8 h fermentation under the conditions of pH 6.6, 37.9 , 10% inoculation amount, 200 r/min rotation speed followed by 10 h of induction with the addition of 0.5 mmol/L IPTG, which made the enzyme activity and of -glucosidase reach up to 147.8 U/mL, respectively. Key words： -glucosidase；genetically engineered bacterial strain；fermentation process 中图分类号：Q784 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0173-05 收稿日期：2009-10-09 基金项目：辽宁省科技厅科技攻关项目(2004205001) 作者简介：刘长江(1955 )，男，教授，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail： -葡萄糖苷酶(EC3,2,1,21)，又称为-D-葡萄糖苷 水解酶，属于纤维素酶类，存在于自然界许多植物体、 酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌内1，能催化水解- 葡萄糖苷键和低聚糖生成葡萄糖的酶。该酶可水解结合 于末端、非还原性的-D-糖苷键，同时释放-D-葡 萄糖和相应的配基2；该酶参与生物体的糖代谢，对维 持生物体的正常生理功能起着重要作用，-葡萄糖苷 酶同时具有水解和合成糖苷键的双重活性使它在许多重 要的生物途径中起关键作用。-葡萄糖苷酶已经被广 泛应用于食品、造酒、医药、化学工业以及饲料加工 等领域中3-4。 1837 年，-葡萄糖苷酶首次在苦杏仁中发现，后 被发现存在于自然界许多植物中，还存在于一些酵母、 曲霉菌、木霉菌及细菌体内5。王沁等6从黑曲霉的稻 草、麸皮培养物的抽提液中得到-葡萄糖苷酶。孟宪 文等7以乳酸菌为初始菌株提取-葡萄糖苷酶并进行条 件优化，开辟了国内从乳酸菌中提取-葡萄糖苷酶并 进行系统研究的先河。现在-葡萄糖苷酶基因已从燕 麦、蜀黍、旱金莲、长春花等植物中进行了克隆和表 达，重组表达的酶活量可达野生株的几十倍乃至上百倍8-9。 李长彪10以德氏乳酸杆菌基因组-葡萄糖苷酶 DNA 为 模板，设计合成一对引物对-葡萄糖苷酶基因进行PCR 扩增，将扩增的- 葡萄糖苷酶基因片段克隆到了 pMD18-TSimple 克隆载体中并测序，成功构建了乳酸菌 产-葡萄糖苷酶的基因工程菌株，但是系统的发酵培 养还没有进行研究。本实验在其基础上对基因工程菌株 进行发酵工艺研究，并对其发酵条件进行优化，以期 为工业化生产-葡萄糖苷酶提供参考。 1材料与方法 1.1材料与试剂 -葡萄糖苷酶基因工程菌(本实验室构建)，70 甘油保存。 IPTG Sigma 公司；卡那霉素、考马斯亮蓝 G-250、蛋白胨、酵母膏、吐温 -80。 1.2仪器与设备 2010, Vol. 31, No. 11食品科学生物工程174 BIOTECH-2002 立式在位灭菌发酵罐 上海保兴 生物设备工程有限公司；JY92-超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；BX41 型光学显微 镜 OLYMPUS 光学有限公司；CR21G 型高速冷冻 离心机、UV-3310 型紫外 -可见分光光度计 日本日 立公司。 1.3方法 1.3.1LB 培养基的制备 蛋白胨 10g、酵母膏 5g、吐温 -80 1g、硫酸镁 0.2g、蒸馏水 1L，121灭菌30min，4冰箱保存备用。 1.3.2菌种活化 挑取一环单菌落接入到 50mL 液体培养基(含卡那霉 素)中，37、180r/min 培养 812h。取一级种子，以 5%接种量转接入250mL液体培养基(含卡那霉素) 中，37、 180r/min 培养 812h。 1.3.3基因工程菌发酵工艺流程 溶氧的测定 pH 值的测定摇瓶倒种 5L 液体 培养基(含卡那霉素 50g/mL)菌种发酵 10h 补料 100mL 液体培养基(含卡那霉素 50g/mL) 0.5mmol/L IPTG 诱导菌种 4h 取样 8000r/min 离心 20min 在 100W 条件下破碎 10min 10000r/min离心 20min 测 定 O D 值。 1.3.4-葡萄糖苷酶比活力的测定 采用 pNPG 发色底物法，取0.4mL 1mmol/L的pNP- -D-Glc(用 0.02mol/L，pH5.0 的醋酸缓冲液配制)，于 40预热 5min，加入 0.1mL 酶液，反应 30min，向反 应液加入2.5mL 1mol/L 的Na2CO3溶液，于450nm 波长 处测 OD 值。酶活力定义为：在上述条件下，每分钟 水解底物所产生 1mol 对硝基苯酚的酶量为一个酶活力 单位 1 1 。以相同条件下所测定的最高酶化活力为 100%，其余与之相比作为相对酶活力。 酶比活力与 OD 值之间的关系式为： y=0.0051x0.0079(R2=0.9998) 式中：y 为 OD 值；x 为酶比活力 /(U/L)。 1.3.5菌体生物量的测定 在波长 600nm 处测定发酵液的光密度，用光密度 大小来判断菌体生物量，同时判断菌体生长速度或衰减 速 度 。 2结果与分析 2.1温度对-葡萄糖苷酶酶活力的影响 保持其他发酵条件不变，只改变温度，发酵后测 定-葡萄糖苷酶相对酶活力。 图1 温度对菌体生物量和相对酶活力的影响 Fig.1 Effect of temperature on biomass and -glucosidase activity 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 菌体生物量 菌体生物量(OD600nm) 温度/ 27323742 相对酶活力 100 80 60 40 20 0 相对酶活力/% 从图 1 可以看出，7L 发酵罐在 2742发酵条件 下，菌体生物量量随着温度的升高而逐渐提高，38 以后随着温度的升高而降低。分析原因是微生物的生长 和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证 酶活性的重要条件。当温度为 38时-葡萄糖苷酶活 力最大，为最适产酶温度。 2.2初始pH 值对-葡萄糖苷酶酶活力的影响 保持其他发酵条件不变，只改变 pH 值，发酵后测 定- 葡萄糖苷酶相对酶活力。 图2 pH 值对菌体生物量和相对酶活力的影响 Fig.2 Effect of pH value on biomass and -glucosidase activity 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 菌体生物量 相对酶活力 菌体生物量(OD600nm) 培养基pH 5.566.577.5 100 80 60 40 20 0 相对酶活力 /% 从图 2 可以看出，当 pH 值为 6.07.0 时生物量 明显增加，但相对酶活变化不大。当 pH 值为 7 时生 物量没有明显变化，但相对酶活力开始降低。当初 始 pH 值较低的时候，过酸的环境明显抑制了乳酸菌 菌体的生长，导致产酶量减少，相对酶活力也随之 降低。考虑到主要培养条件之间的交互作用确定最 佳 pH 值为 6.5。 2.3接种量对-葡萄糖苷酶酶活力的影响 其他发酵条件不变，分别按 6 % 、8 % 、1 0 % 、 12%、14% 的接种量进行发酵培养，比较接种量对- 葡萄糖苷酶酶活力的影响，结果见图 3。 175生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11 图3 接种量对菌体生物量和相对酶活力的影响 Fig.3 Effect of inoculation amount on biomass and -glucosi- dase activity 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 菌体生物量 菌体生物量(OD600nm) 接种量/% 68101214 相对酶活力 100 80 60 40 20 0 相对酶活力/% 由图 3 可以看出，10% 的接种量其相对酶活力最 高，接种量从 6% 增大到 10%，相对酶活力随之增加； 接种量从 10% 增大到 14%，相对酶活力反而降低，分 析原因可能是由于在接种量低于 10% 的情况下，接种 量过小，产物积累的少，接种量过小，不利产酶； 但接种量过大可能会引起菌体生长过快，发酵液黏度增 加而造成溶氧不足，反而影响了-葡萄糖苷酶相对酶 活 力 。 2.4转速对-葡萄糖苷酶酶活力的影响 其他发酵条件不变，分别以120、160、200、240、 280r/min 转速发酵，比较摇床转速对-葡萄糖苷酶相 对酶活力的影响。 由图 4 可知，由于大肠杆菌是属于好氧微生物，在 生长和诱导阶段对溶氧的需求很高，随着发酵罐搅拌转 速的增加，相对酶活力和菌体生物量都明显提高了，但 搅拌过快，相应的剪切力增加，对菌体会有伤害，同 时过大的搅拌速度对设备的要求较高，所以最适合工程 菌生长和产酶的转速240r/min。 2.5诱导时间对-葡萄糖苷酶酶活力的影响 其他发酵条件不变，分别诱导菌种 8、9、10、11、 12h，比较诱导时间对-葡萄糖苷酶酶活力的影响。 图4 转速对菌体生物量和相对酶活力的影响 Fig.4 Effect of rotation speed on biomass and -glucosidase activity 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 菌体生物量 相对酶活力 菌体生物量(OD600nm) 转速/(r/min) 120160200240280 100 80 60 40 20 0 相对酶活力/% 由图5 可见，诱导时间对相对酶活力的影响比较显 著，对菌体生物量的影响不显著，由于菌体大量表达 随着诱导时间的增加相对酶活力增大，当诱导到10h 为 菌体繁殖高峰，相对酶活力达到最大，随着代谢产物 的累积和溶氧的下降表达能力下降，相对酶活力减小。 相对比酶活力对照提高了 10%。所以最佳诱导时间为 10h。 2.6二次回归拟合及方差分析 图5 诱导时间对菌体生物量和相对酶活力的影响 Fig.5 Effect of induction time on biomass and -glucosidase activity 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 菌体生物量 菌体生物量(OD600nm) 诱导时间/h 89101112 100 80 60 40 20 0 相对酶活力/% 相对酶活力 试验号A温度/B初始pHC 诱导时间/h酶比活力/(U/L) 137.007.0011.68121 232.008.009.0075 345.417.0010.00107 428.597.0010.0089 542.008.009.00101 637.007.008.3297 737.007.0010.00152 837.007.0010.00140 942.008.0011.0079 1042.006.0011.00127 1132.006.009.0083 1237.007.0010.00147 1342.006.009.00115 1437.007.0010.00143 1537.008.6810.00100 1637.005.3210.00113 1732.008.0011.0097 1832.006.0011.00113 1937.007.0010.00142 2037.007.0010.00147 表2 N=20 Central Composite Design 试验设计 Table 2 Arrangement and experimental results of the central composite design 依据单因素试验结果，可以看出，温度、初始 pH 水平 因素101 A温度/323742 B初始pH678 C 诱导时间/h91011 表1 三因素三水平的取值表 Table 1 Factors and levels in the central composite design 2010, Vol. 31, No. 11食品科学生物工程176 方差来源平方和自由度均方F值大于F 值的概率 模型11075.7091230.6331.630.0001 A520.021520.013.360.0044 B851.921851.9221.890.0009 C496.721496.7212.770.0051 A24347.5114347.51111.730.0001 B22973.2212973.2276.410.0001 C22618.5512618.5567.300.0001 AB180.501180.504.640.0567 AC480.501480.5012.350.0056 BC220.501220.505.670.0386 残差389.101038.91 失拟项294.27558.853.100.1198 纯误差94.83518.97 总回归11464.8019 表3 方差分析表 Table 3 Variance analysis for the -glucosidase activity with various fermentation conditions 图6 酶比活力与温度、pH 值的响应面图及等高线图 Fig.6 Response surface and contour plots showing the relationship between -glucosidase activity and temperature and pH value 图7 酶比活力与温度、诱导时间的响应面图及等高线图 Fig.7 Response surface and contour plots showing the relationship between -glucosidase activity and temperature and induction time 值、诱导时间对酶比活力影响显著，溶氧量、接种量、 转速对酶比活力影响不显著，因此选择温度、初始 pH 值、诱导时间 3 个因素为变量，酶比活力为响应值， 安排了中心组合试验设计。设计了三因素三水平共 20 个 试验点的响应面分析试验，因素水平选取见表 1，试验 方案及结果见表 2。 利用 Design Expert 软件对表2 试验数据进行二次多 项回归拟合获得-葡萄糖苷酶酶比活力对温度、发酵 罐 pH 值、以及发酵时间的二次多项回归方程： y = 145.27+6.17A7.90B+6.03C17.37A214.36B2 113.48C24.75AB7.75AC 5.25BC 最佳发酵条件：温度为37.9343；pH值为6.64326； 诱导时间为10.2314h，最大酶比活力为147.898U/L。 对二次多项回归方程进行显著性验证和方差分析， 结果见表 3 。 由表 3 可以看出，模型回归效果极显著，相关系 数 R2=0.9829 说明该模型拟合程度良好，试验误差小。 预测值与实测值之间具有高度相关性(R2=0.9661)，该模 型是合适的，可以用来分析和预测基因工程菌的产 酶 量 。 对方程中因素和结果绘制响应面。 由图 6 可知，当诱导时间为 10h 条件下，温度和 发酵 pH 值两个因素之间交互作用，酶比活力在温度为 3739.5，发酵 pH 值为 6.507.00 时达到最大。诱 导时间对酶比活力影响很大。从图 7 可知，在 pH 值为 7 时，温度和发酵 pH 值两个因素之间交互作用显著， 酶比活力在温度为3739.5，诱导时间为 10h，表现 出最高值。由图 8 可知，在发酵温度为 37时，诱导 时间和 pH 值两个因素之间交互作用，酶比活力在诱导 时间 10h， pH 值为6.507.00 时达到最大。 152 8.0 酶比活力/(U/L) pH 140 128 116 104 7.5 7.0 6.5 6.032.0 34.5 37.0 39.5 42.0 温度/ 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 pH 32.034.537.039.542.0 温度/ 111.381 118.541125.7 132.86 140.02 118.541 118.541 6 152.0 11.0 酶比 活力/(U/L) 时间/h 10.5 10.0 9.5 9.032.0 34.5 37.0 39.5 42.0 温度/ 137.5 123.0 106.5 54.0 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 时间/h 32.034.537.039.542.0 温度/ 103.102 111.731 120.36128.989 137.618 120.36 6 152 8.0 酶比活力/(U/L) pH 7.5 7.0 6.5 6.0 141 130 119 108 11.0 时间/h 10.5 10.09.5 9.0 177生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11 图8 酶比活力与诱导时间、pH 值的等高线图和响应面图 Fig.8 Response surface and contour plots showing the relation- ship between -glucosidase activity and induction time and pH value 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 时间/h 6.06.57.07.58.0 pH 121.644 140.984 121.644 134.537 128.091 121.644 115.197 6 图 68 说明了温度、发酵 pH 值、以及诱导时间 对-葡萄糖苷酶酶活力的影响。当温度过高时，酶活 力降低的原因是蛋白质在高温下容易失去活性，减少 -葡萄糖苷酶产量；当温度过低时抑制了酶的活性， 从而降低了-葡萄糖苷酶酶活力。诱导时间过长工程 菌产生大量次生代谢产物，阻止了正常的基因表达速 度，影响酶活力；诱导时间过短工程菌没有表达彻底， 导致酶活力不高。 3结 论 本实验研究了温度、初始 pH 值、接种量、转述、 诱导时间对基因工程菌产-葡萄糖苷酶所需的条件的影 响，再通过响应面试验方法对发酵工艺进行优化，确 定基因工程菌产-葡萄糖苷酶所需最佳培养条件为： 温度 37.9、pH6.6、接种量10%、转速200r/min、诱 导时间 10h，得到最佳酶比活力为 147.8U/L。 参考文献： 1WOODWARD J, WISEMAN A. Fungal and other - glucosidases. Their properties and applicationsJ. Enzyme Microbial Technol, 1982 (4): 73-79. 2王华夫, 游