保加利亚乳杆菌发酵乳清的抗氧化性研究.pdf

Science and Technology of Food Industry 研究与探讨 2012年第9期 自从Harman提出自由基理论以来，人们认识到 人体内氧化产生的自由基与人的衰老和很多疾病有 关1。根据自由基理论， 机体衰老是体内过剩的自由 基对构成组织细胞的生物大分子化学结构产生破坏 性反应的结果。抗氧化活性物质通过抑制自由基的 产生， 清除、 淬灭自由基来抑制自由基参与的过氧化 反应即为抗氧化作用。国内外研究人员已从不同来 源蛋白质中提取到各种具有抗氧化活性的肽类物 质，也有一些乳清蛋白酶解物抗氧化活性的研究报 道2-5， 乳杆菌属的一些菌株具有抗氧化的作用6-7。 但 保加利亚乳杆菌发酵乳清的抗氧化活性的研究报道 较少。本研究通过控制保加利亚乳杆菌发酵乳清的 工艺条件， 提高乳清水解物的抗氧化活性， 并对蛋白 水解度、 活菌数与抗氧化活性之间的关系进行分析。 刘晶1，2，孟杨2，赵征1，* （1.天津科技大学食品与生物技术学院，天津300457； 2.河北经贸大学生物科学与工程学院，河北石家庄050061） 摘要：通过控制初始发酵条件：pH 6.0、发酵温度39，可以提高发酵乳清清除羟基自由基和DPPH的能力。 在发酵 20h内，随着乳清蛋白水解度的增加，发酵乳清清除羟自由基和DPPH的能力也随之增大，在发酵20h时达到最大，分 别为48.06%和73.52%，发酵乳清清除羟自由基和DPPH的能力与未发酵乳清相比分别提高了22.73%和46.09%，与保 加利亚乳杆菌菌体相比分别提高了23.75%和40.63%。 探讨了蛋白水解度和保加利亚乳杆菌活菌数和抗氧化活性之 间的关系。20h后，发酵液自由基清除能力与水解度之间没有正相关性，因此不能采用蛋白水解度作为评价发酵乳清 抗氧化性的指标。 本研究对可能影响保加利亚乳杆菌发酵乳清抗氧化性的因素进行探讨，为开发功能性乳清产品奠 定了理论和实践基础。 关键词：保加利亚乳杆菌，羟基自由基清除能力，DPPH清除能力，抗氧化活性 Study on antioxidative activity of whey fermented by Lactobacillus Bulgaricus LIU Jing1，2，MENG Yang2，ZHAO Zheng1，* （1.College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China； 2.College of Bioscience and bioengineering， Hebei University of Economics and Business， Shijiazhuang 050061， China ） Abstract： Hydroxyl radical and DPPHscavenging ability were improved by controlling the initial fermentation conditions：pH 6.0 and fermentation temperature 39. With the increasing of the degree of hydrolysis of whey protein，hydroxyl radical and DPPHscavenging ability increased in 20h during fermentation，and reached 48.06% and 73.52% at 20h. Compared with whey，fermentation could increase hydroxyl radical and DPPH- scavenging ability 22.73% and 46.09%，respectively. And compared with Lactobacillus bulgaricus bacteria，the increasing was 23.75% and 40.63%，respectively. The relationships between hydrolysis degree of protein， number of viable cells and antioxidant capacity were discussed. There was no positive correlation between the degree of hydrolysis and radical-scavenging ability after 20h，so，hydrolysis degree of protein could not be used as determination index to evaluate the antioxidant capacity of whey hydrolysates. The factors that affected the antioxidant capacity of whey hydrolysates prepared by Lactobacillus bulgaricus were discussed in the research，which laid the theoretical and practical basis for the development of functional whey products. Key words： Lactobacillus bulgaricus； hydroxyl radical-scavenging ability； DPPH scavenging ability； antioxidant activity 中图分类号：TS201.3文献标识码：A文 章 编 号：1002-0306（2012）09-0146-04 收稿日期：20110815*通讯联系人 作者简介：刘晶（1974），女，在读博士，副教授，研究方向：乳与乳制 品加工。 保加利亚乳杆菌发酵乳清的 抗氧化性研究 !“ !“ !“ !“ 146 研究与探讨 Vol.33,No.09,2012 2012年第9期 探讨了可能影响保加利亚乳杆菌发酵乳清抗氧化性 的因素， 对综合利用乳清， 开发新的功能性乳饮料具 有重要的理论和实践意义。 1材料与方法 1.1实验材料 保加利亚乳杆菌天津科技大学干酪科学与工 程研究室保存。 1.2实验方法 1.2.1实验流程脱脂纯牛乳加稀盐酸至pH4.6并不断 轻轻搅拌离心除去酪蛋白得到酸乳清5560真空旋蒸 除去原体积2/3的水调节乳清的pH装入无菌三角瓶杀 菌（63/30min）接种保加利亚乳杆菌（3%，v/v）静置发酵 测定蛋白质水解度、活菌数及抗氧化性 1.2.2羟自由基清除能力的测定8在10mL的试管 中依次加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL、 一定浓度的样 品溶液1mL、 6mmol/L的H2O2溶液1mL， 摇匀， 静置 10min， 再加入9mmo/L的水杨酸溶液1mL， 最后加入 4mL蒸馏水， 摇匀， 静置30min后于510nm处测其吸光 值。清除率计算公式为： 清除率 （% ） =1- （Ai-Aj） /A0100% 其中： A0为空白对照； Ai为多肽的吸光值； Aj为无 水杨酸时多肽的吸光值。 1.2.3DPPH自由基清除能力的测定9取样品2mL， 加入0.2mmol/L DPPH， 无水乙醇1mL， 混匀后在室温 下避光反应30min， 并在6000r/min下离心10min， 取上 清液测定吸光度Ai。 空白组 （Aj） 以等体积无水乙醇代 替DPPH溶液， 对照组 （A0） 以等体积蒸馏水代替样品 溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调 零， 在517nm下测定吸光度。清除率按下式计算： 清除率 （% ） 1- （Ai-Aj） /A0100 1.2.4蛋白质水解度的测定： pH-Stat法10水解开始 时， 调节反应体系的pH为6.0， 在反应过程中不断搅 拌， 并滴定1mol/L NaOH以维持pH恒定不变， 每隔一 定时间记录1mol/L NaOH的消耗量， 按下式计算乳清 蛋白的水解度： DH （% ） =VNaOH （1/ ） （CNaOH/Mp ） （1/htot） 100% 式中： VNaOH水解过程中用去的Na0H的量， mL； MP蛋白质总量， g； CNaOHNaOH的浓度， mol/L； htot 氨基酸的平均解离度 （8.8mmol/g ） 。 氨基的解离度可按下式计算： = 10pH-pK 1+10pH-pK 式中： pH实验时采用的pH； pK氨基的解离 常数。 1.2.5发酵液中菌体的收集发酵液采用4000r/min， 4离心10min， 收集的菌体经去离子水两次洗涤后， 再将菌体细胞重悬至发酵液原来的体积。 2结果与讨论 2.1发酵产物抗氧化性与发酵初始pH的关系 乳清的初始pH可能从三个方面影响乳杆菌的生 长和蛋白水解能力： 一是引起细胞膜电荷的变化， 从而 影响了微生物对营养物质的吸收； 二是影响代谢过程 中酶的活性， 影响菌体细胞内各种酶活、 菌体对基质 的利用速率和细胞的结构， 从而影响菌体的生长和产 蛋白酶能力11-12； 三是改变生长环境中营养物质的可 给性， 从而影响保加利亚乳杆菌对乳清中营养成分的 利用。由图1可知， 保加利亚乳杆菌发酵乳清产物的 羟自由基和DPPH自由基的清除能力在pH6.0时达到 最大， 清除率分别为47.60%和65.51%。 2.2发酵产物抗氧化性与发酵温度的关系 温度是影响保加利亚乳杆菌生长与代谢的最重 要的因素之一。 它对生活机体的影响表现在两方面： 一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速 率和生长速率加快， 从而影响蛋白酶的水解效力； 另 一方面， 机体的重要组成如蛋白质、 核酸等对温度都 较敏感， 随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。 因此， 只有在一定范围内， 机体的代谢活动与生长繁 殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程 度， 开始对机体产生不利影响， 如再继续升高温度， 则细胞数量急剧下降以至死亡。由图2可知， 保加利 亚乳杆菌发酵乳清产物的羟自由基和DPPH自由基 的清除能力随发酵温度的升高呈增加趋势， 当发酵 温度为39时分别达到39.09%和72.93%， 温度继续 升高， 抗氧化活性不再升高， 反而略有下降。 2.3发酵产物抗氧化性和蛋白质水解度的关系 由图3可知， 保加利亚乳杆菌发酵乳清产物清除 羟自由基的能力和清除DPPH自由基的能力总体上 是随发酵时间的延长呈现增加的趋势。清除羟自由 基的能力到发酵20h时达到最大48.06%， 比未发酵乳 清高22.73%， 发酵20h后， 清除羟自由基的能力开始 下降；清除DPPH自由基的能力在发酵20h时达到 73.52%， 比未发酵乳清高46.09%， 之后不再升高。发 图1发酵产物抗氧化性与发酵初始pH的关系 Fig.1The relationship between antioxidant capacity of fermentation product and initial pH of fermentation 清除率 （% ） 70 65 60 55 50 45 40 35 pH OH DPPH 5.05.56.06.57.0 图2发酵产物抗氧化性与发酵温度的关系 Fig.2The relationship between antioxidant capacity of fermentation product and fermentation temperature 清除率 （% ） 温度 （ ） OH DPPH 80 70 60 50 40 30 2033 36394245 147 Science and Technology of Food Industry 研究与探讨 2012年第9期 酵时间增加， 发酵液的水解度不断增大。 在20h以前， 这种趋势与羟自由基和DPPH自由基清除能力的变 化相似，即随着水解度的增大自由基清除能力也增 大。蛋白的水解度经常被作为评价蛋白水解物功能 特性的指标。20h后虽然水解度增大， 但是抗氧化活 性均不再增加。 因此在评价乳清水解物抗氧化性时， 不适宜采用蛋白的水解度作为测定指标。 2.4发酵液活菌数对产物抗氧化活性的影响 由图4可知， 在发酵过程中， 乳清发酵液中的活 菌数先一直在增加， 在发酵2226h时达到最高， 而后 有下降趋势。 因为竞争营养物质、 乳酸含量增大以及 菌体自身进入衰亡期， 导致活菌数下降。22h以前活 菌数在不断增加， 菌体抗氧化活性也在不断增大， 羟 基自由基和DPPH 清除能力分别达到了24.31%和 32.89%， 在26h后活菌数开始下降， 自由基清除能力 也有下降的趋势。保加利亚乳杆菌具有清除羟基自 由基和DPPH 的能力 （图4 ） ， 但是远远低于保加利亚 乳杆菌发酵后乳清的自由基清除能力 （图3 ） 。 造成保 加利亚乳杆菌发酵乳清体系自由基清除能力升高的 因素主要有两方面： 其一， 乳酸菌的完整细胞、 菌体 死亡裂解后细胞内的无细胞提取物和乳酸菌的代谢 产物 （含硫化合物、 二硫苏糖醇、 半胱氨酸和还原型 故谷胱甘肽等 ） 都可能具有抗氧化活性13-15， 在发酵 时间超过22h后，保加利亚乳杆菌进入菌体数稳定 期， 一方面菌株生长， 一方面菌株衰亡自溶， 胞内的 抗氧化物质被释放出来，同时具有抗氧化活性的代 谢产物进一步积累； 其二， 乳清蛋白水解后， 释放了 具有抗氧化作用的氨基酸残基，使乳清自由基清除 能力有所提高16。因此与保加利亚乳杆菌相比， 乳清 发酵体系的抗氧化性大大提高。 3结论 保加利亚乳杆菌在pH6.0， 39发酵乳清可以提 高乳清清除羟基自由基和DPPH 的能力。发酵乳清 清除羟基自由基和DPPH 的能力高于未发酵乳清和 保加利亚乳杆菌菌体。在发酵20h时达到最大， 分别 为48.06%和73.52%， 发酵乳清清除羟自由基和DPPH 的能力与未发酵乳清相比分别提高了22.73%和 46.09%，与保加利亚乳杆菌菌体相比分别提高了 23.75%和40.63%。乳清蛋白的水解度和保加利亚乳 杆菌的活菌数都对发酵乳清的抗氧化性有一定的影 响，不能将乳清蛋白的水解度作为评判发酵乳清抗 氧化性的指标。 参考文献 1 Harman D. Aging：a theory based on free radical and radiation chemistryJ. J Gerontol，1956，11（3）：298-300. 2 Tong L M，Sasaki S，McClements，et al. Antioxidant activity of whey in a salmon oil emulsionJ. Journal of Food Science， 2000，65（8）：1325-1329. 3 Saiga A，Tanabe S，Nishimura T. Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment J. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（12）： 3661-3667. 4 Virtanen T，Pihlanto A，Akkanen S，et al. Development of antioxidant activity in milk whey during fermentation with lactic acid bacteriaJ. Journal of Applied Microbiology，2007，102（1）： 106-115. 5 Wang Y C，Yu R C，Chou C C. Antioxidative activities of soymilk fermented with lactic acid bacteria and bifidobacteriaJ. Food Microbiology，2006，23（2）：128-135. 6 Lee J，Hwang K T，Heo M S，et al. Resistance of Lactobacillus plantarum KCTC 3099 from Kimchi to oxidative stressJ. Journal of Medicine Food，2005，8（3）：299-304. 7 Lin M Y，Chang F J. 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Antioxidative 图3发酵产物抗氧化性与蛋白质水解度的关系 Fig.3The relationship between antioxidant capacity of fermentation product and hydrolysis degree of protein 百分数 （% ） 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 02468 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 时间 （h ） OH DPPH 水解度10 图4发酵液活菌数对抗氧化活性的影响 Fig.4The effect of number of viable cells in fermentation broth on the antioxidant capacity 清除率 （% ） 时间 （h ） OH DPPH 活菌数 1g活菌数 （cfu/mL ） 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 40 35 30 25 20 15 10 5 0 9 8 7 6 5 148 研究与探讨 Vol.33,No.09,2012 2012年第9期 properties of Lactobacillus sake upon exposure to elevated oxygen concentrationsJ. FEMS Microbiology Letters，2001，203 （1）：87-94. 15 Kullisaar T，Zilmer M，Mikelsaar M，et al. Two antioxidative lactobacilli strains as promising probioticsJ. International Journal of Food Microbiology，2002，72（3）：215-224. 16 Elias R J，McClements D J，Decker E A. Antioxidant activity of cysteine，tryptophan，and methionine residues in continuous phase -lactoglobulin in oil-in-water emulsionsJ. J Agric Food Chem，2005，53（26）：10248-10253. ! 腌肉制品是我国传统的肉制品之一， 腌制技术主 要有干腌、 湿腌、 混合腌制和盐水注射腌制等方法1。 湿腌法是常用的腌制方法， 采用传统工艺渗透均匀， 但是腌肉的腌制工艺主要依靠高盐分，并且没有促 进食盐快速渗透的有效手段，这就造成了食盐渗透 缓慢且不均匀， 产品口感、 质量不稳定， 腌制时间长， 不宜保藏等问题。 自20世纪90年代以来， 超声波正逐 渐被用于肉品加工工艺中， 现普遍认为空化效应、 热 效应和机械效应是超声波技术的三大理论依据2。 研 究发现， 超声波处理可加快肉品的腌制速度， 提升肉 品嫩度， 增加保水性等。如李兰会等3采用频率 40kHz， 电功率1000W， 强度为1.33W/cm2的超声波水 浴处理山羊肉块35min，明显提高了肉块的嫩化速 率。蔡华珍等4-5研究表明超声波的空化效应能促进 猪肉盐分的渗透和扩散； Lyng等6用一定范围的低频 率超声波处理牛肉之后，证明超声波处理技术可以 提高牛肉的嫩度， 缩短成熟期， 增加其经济效益。本 实验以渗透速度和肉质为测试指标， 探讨超声功率、 超声时间与间歇时间比、超声时间对湿腌猪肉腌制 效果的影响，为超声波应用于湿腌猪肉的加工提供 更有利的参数，同时为超声波应用于其他肉制品加 工工艺提供理论参考与借鉴。 1材料与方法 1.1材料与仪器 猪肉经兽医卫检合格的新鲜猪背脊肉； 食盐购 于重百超市； 蔗糖、 维生素C、 三聚磷酸钠、 亚硝酸盐 崔龄文，王梅，汪学荣* （西南大学荣昌校区动物科学系，重庆402460） 摘要：主要研究了超声功率、超声时间与间歇时间比、超声时间对湿腌猪肉腌制速度及肉质的影响。实验结果表明， 超声波处理可以加速腌制液中食盐、亚硝酸盐和蔗糖向湿腌猪肉的渗透，加快腌制速度，并且增加肉的保水性，提高 肉的嫩度，将蒸煮损失控制在合理范围之内。 通过L9（34）正交实验得到超声波最佳处理工艺条件为超声功率300W，超 声时间与间歇时间比11，超声处理时间90min。 关键词：超声波，猪肉，腌制，渗透速度，肉质 Effect