保加利亚乳杆菌对乳清水解物抗氧化性的影响.pdf

V ， 、 w c h i na da i r y n e t z g r p g y 1 6 3 C O rn 中国乳 品工业 d a r y I ND US T R Y 保加利亚乳杆菌对乳清水解物抗氧化性的影响 刘晶 一 ， 苗颖。 ， 韩清波 ， 赵征 ( 1 天 津 科 技 大 学 食 品 与 生物 技 术 学 院 ， 天 津 3 0 0 4 5 7 ； 2 河 北 经 贸 大 学 生 物 科 学 与 工 程 学 院 ， 石 家 庄 0 5 0 0 6 1 ； 3 天 津 农 学 院 食 品 科 学 系 ， 天 津 3 0 0 3 8 4； 4 石 家 庄 君 乐 宝 乳 业 有 限公 司 石 家 庄 0 5 0 2 2 1 ) 摘 要 ： 通过测定乳清水解物及其发酵液清除羟基 自由基 、 1 ， 1 一 二 苯基苦基苯肼 ( DP P H) 的能力 抑 制脂类氧化和螯合金属 离子 的能 力来评价其抗氧化活性 。 采用保加利亚乳杆菌对乳清水解物进行发酵可以使抗氧化性提 高1 1 9 3 7 活细胞 、 细胞裂解液 中的抗氧化 物质、 胞 外代谢产物的抗氧化性是发酵液抗氧化性提 高的原 因。 研 究结果表 明， 与蛋 白酶直接作用的乳 清水解物相比 加入保加利 亚乳 杆 菌可以改善 乳清水解液的抗氧化活性 ， 乳酸菌发 酵的乳清水解液可以作 为天然的抗氧化 剂来改善食品的品质 关键词 ： 乳清水解物 ； 抗氧化活性 ； 自由基 清除活性 ； 脂类氧化 ； 金属 离子螯合能力 ： 保加利亚乳杆 菌 中图分类号： TQ9 2 0 1 ， T S 2 5 2 1 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 1 2 2 3 0 ( 2 0 1 2 ) 0 2 0 0 1 7 0 3 Effe c t of La c t o b a c i l l u s Bu l ga r i c u s on t he a nt i o x i da t i ve a c t i v i t y of whe y h ydr o l y s a t e s L I U J i n g 1 2 , MI A O Yi n g 3 ， HA N Qi n g b o 4 , Z ，HAO Zh e ng ( 1 Co l l e g e o f F o o d E n g i n e e r i n g a n d Bi o t e c h n o l o g y ，Ti a n j i n Un i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d Te c h n o l o g y ，Ti a n j i n 3 0 0 4 5 7 ， Ch i n a ； 2 Co l l e g e o f Bi o s c i e n c e an d b i o e n g i n e e r i n g ， He b e i Un i v e r s i ty o f E c o n o mi c s an d Bu s i n e s s ，S h i j i a z h u a n g 0 5 0 0 6 1 ， Ch i n a ； 3 De p a r t me n t o f f o o d s c i e n c e ，Ti a n j i n Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i ty Ti a n j i n 3 0 0 3 8 4 Ch i n a ； 4 S h i j i a z h u a n g J u n l e b a o Da i r y Co ， L t d ， S h i J i a z h u a n g 0 5 0 2 2 1 ， Ch i n a ； ) Abs t r a c t： Ant i o x i d a t i ve a c t i vi t y of whe y h yd r o l ys a t e s a n d i t s f e r m e n t a tion b r ot h wa s me a s ur e d vi a t he de t e r mi na tio n on h y dr o x y l r a d i c a l e - l i m i n a ti n g a b i l i ty，1 ， 1 一 Di p h e n y l 一 2 一 p i c r y l h y d r a z y l ， ( D P P H) 一 s c a v e n g i n g a c t i v i ty， i n h i b i ti o n a c ti v i ty o fl i p i d p e r o x i d a ti o n ， a n d me t al i o n c h e l a ti n g a c ti v i ty F e r me n t a ti o n o f wh e y h y dr o l y s a t e s wi t h L a c t o b a c i l l u s b u Ig a r i c u s c o u l d i n c r e a s e t h e a n t i o x i d a ti v e a c ti v i ty 1 1 9 一3 7 An t i o x i d a ti v e a c t i v i ty o f v i a b l e c e ll ， an ti o x i d a n t s i n c e l l l y s i s p r o d u c t s ， a n d e x t r a c e i l ula r me t a b o l i t e s c o u l d e x p l a i n t h e r e a s o n O u r r e s ult s s u g g e s t e d t h a t a d d i ti o n o f L a c t o b a c i U u s b u 如ri c u s c o u l d i mp r o v e t h e a n ti o x i d a ti v e p r o p e r t i e s o f wh e y h y d r o l y s a t e s c o m p a r e d wi t h h y d r o l y s a t e s p r e p a r e d o n l y b y p r o t e i n a s e Th e wh e y h y d r o l y s a t e s f e r me n t e d、 i c h L a c t i c a c i d b a c t e ri a l c o uld b e f a v o r a b l e a S n a t u r a l a d diti v e in i mp r o v e t h e q u a l i t y o f f o o d s y s t er ns Ke y w o r d s ： wh e y h y d r o l y s a t e s ； a n t i o x i d a t i v e a c ti vit y ； r a d i c al s c a v e n g i n g a c ti v i ty ； l i p i d o x i d a ti o n ；me t a l c h e l a t i n g c a p a c i ty；L a c t o b a c i l l u s b u Ig a r i c u s 0 引 言 自从 Ha r n 1 a n 提 出 自 由 基 理 论 以 来 人 们 认 识 到 人 体 内 氧 化 产 生 的 自 由 基 与 人 的 衰 老 和 很 多 疾 病 有 关 【 1 】 。 抗 氧 化 活 性 物 质 通 过 抑 制 自由 基 的 产 生 。 清 除 、 熄 灭 自由 基 来 抑 制 自由基 参 与 的 过 氧 化 反 应 近 年 来 的 一 些 研 究 发 现 牛 乳 蛋 白及 其 酶 解 物 能 够 抑 制 脂 类 自动 氧 化 并 具 有 自 由 基 清 除 活 性 4 1 。 To n g 等 人 将 乳 清 分 成 两 部 分 ， 高 分 子 量 部 分 ( HMW ) 和 低 分 子 量 部 收稿 日期： 2 0 1 1 1 0 1 4 基金项 目： 河北省科技厅技术研究与发展项 目“ 乳酸菌胞外 多糖 的提取 及应用 ” ( 0 7 2 1 5 5 1 9 ) 。 作者简介 ： 刘晶 ( 1 9 7 4 一) ， 女 ， 副教 授 ， 主要从事乳 与乳制品加工方 面的 研究 通讯作者 ： 赵征 分 ( L MW ) t s 。 HMW 的 主 要 抗 氧 化 物 质 为 乳 清 蛋 白 与 L M W 相 比 HMW 是 乳 清 中 的 主 要 抗 氧 化 物 质 因 此 ， 乳 清 蛋 白 是 乳 清 中 主 要 的 抗 氧 化 物 质 。有 研 究 采 用 酶 解 或 发 酵 的 方 式 提 高 乳 清 抗 氧 化 特 性 但 没 有 加 入 乳 酸 菌 对 乳 清 酶 解 物 抗 氧 化 特 性 改 变 的 研 究 报 告 。本 研 究 采 用 加 入 保 加 利 亚 乳 杆 菌 的 对 乳 清 水 解 物 抗 氧 化 性 的 改 善 做 为 研 究 重 点 探 讨 了 产 生 这 一 原 因 的 机 制 1 实 验 1 1 材 料 保 加 利 亚 乳 杆 菌 ， 胰 凝 乳 蛋 白酶 ( 进 口 ) 。 1 2方 法 1 2 1乳 清发 酵 水 解 物 的 制 备 脱 脂 纯 牛 乳 加 稀 盐 酸 至 D H值 为 4 6 并 不 断 轻 轻 搅 拌 ， 离 心 除 ( 3 0 0 0 r mi n ，1 0 mi n ) 去 酪 蛋 白 得 到 乳 清 ， 1 7 研 究报告 Re s e a r c h P a p e r s 调 节 p H值 为 7 0， 再 离 心 ( 3 0 0 0 r mi n ， 1 0 r n j n ) 。真 空 旋 转 蒸 发 浓 缩 乳 清 到 1 0 g L 溶 液 。 胰 凝 乳 蛋 白酶 酶 解 乳 清 的条 件 ： 温 度 5 O ； 酶 底 物 比 为2 ： 1 0 0 。酶 解 2 h 后 ， 巴 氏 灭 菌 。 保 加 利 亚 乳 杆 菌 ( 体 积 分 数 为 3 ) 加 入 乳 清 水 解 液发 酵2 4 h 。发 酵液冻 干后 ， 存 于 - 8 0 o C。 清 除 羟 自 由 基 ( OH) 测 定 按 照 S mi mo ff 等 人 嘲的 方 法 ： 清 , DP P H测 定 按 照 L i n 等 人 的 方 法 ； 金 属 离 子 螯 合 能 力 的 测 定 按 g P e n g 等 人 嘲 的 方 法 。 抑 制 脂 类 氧 化 能 力 的 测 定 按 照 L i n 等 人 7 1 的 方 法 。 2 ， 6 一二 叔 丁 基 -4 -甲基 苯 酚 ( BHT ， 9X1 0 ) 作 为 阳 性 对 照 2结 果 与 讨 论 2 1羟 基 自 由基 清 除 活 性 图 1 为 发 酵 时 间 对 乳 清 水 解 发 酵 液 清 楚 羟 基 自 由 基 及 保 加 利 亚 乳 杆 菌 活 菌 数 的影 响 。 辞 妲 烬 醐 皿 醐 0 - 0 5 0 黎 s O 蜒 5 O 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 16 1 8 2 0 2 2 2 4 发 酵 时 间 h _ 羟基 自由基清除能力： L g ( 活菌数) 图1 时间对羟基 自由基及活菌数的影 响 由 图 1 可 以 看 出 加 入 保 加 利 亚 - L T -T - 菌 可 以 显 著 提 高 经 胰 凝 乳 蛋 白酶 水 解 的乳 清 肽 清 除 羟 基 自 由基 的 能 力 ， 提 高 了 1 1 9 。已经 证 明 ， 一 些 乳 酸 菌 的完 整 的 细 胞 和 细 胞 内 的无 细 胞 提 取 物 具 有 抗 氧 化 活 性 在 发 酵 1 2 1 8 h 时 清 除 活 性 迅 速 升 高 一 方 面 是 乳 酸 菌 在 这 一 阶 段 迅 速 增 殖 ， 一 方 面 部 分 菌 体 死 亡 、 裂 解 ， 胞 内的 无 细 胞提 取 物 进 入 到 发 酵液 这 都 有 助 于 提 高体 系 的清 除羟 基 的能 力 。此 外 乳 酸 菌 的代 谢 产 物 ( 含 硫 化合 物 、 二 硫 苏 糖 醇 、 半 胱 氨 酸 和还 原 型 故 谷 胱 甘 肽 等 ) 水 解 乳 后 抗 氧 f - L 的产 生 等 都是 羟 自由基 清 除 能力 提 高 的 原 因1 2 - 1 4 在 发 酵 2 2 h 时羟 基 自由基 清 除活 性 达 到最 高 8 0 而 后 有 下 降趋 势 。 因 为竞 争 营养 物 质 、 乳 酸含 量 增 大 以及 菌 自身 进入 衰亡 期 ， 导致 活 菌 数 下 降 。2 0 h 以前 活 菌 数 在不 断增 加 ， 此 时 产 物 的抗 氧 化活 性 也在 不 断增 大 在 2 2 h 后 活 菌 数 开 始 下 降 可 能是 由于 菌 体 死 亡后 菌体 自溶 释 放 了一 定量 的蛋 白酶 蛋 白酶水 解 了具 有 抗 氧 化 活 性 的基 团 从 而使 发 酵 产 物 的抗 氧化 活 性 减 小 。 结 果 显示 活 菌数 对 抗 氧化 活 性 有 影 响 ， 抗 氧 化 活性 随活 菌 数 的变 化 而 变 化 2 2 DP P H 自 由基 清 除 活 性 测 定 DP P H 除 活 性 是 筛 选 抗 氧 化 物 质 的 常 用 方 法 之 一 ，此 外 还 有 很 多 测 定 自由 基 清 除 活 性 的 方 法 如 羟 基 自 由 基 、 超 氧 阴 离 子 自 由 基 等 。 测 定 清 除 稳 定 自 由基 n DP P H、 2， 2 一 联 氮 一二( 3 -乙 基 一苯 并 噻 唑 一 6 一磺 酸 ) 二 铵 盐 ( AB TS +) 、 偶 氮 二 异 丁 基 脒 二 盐 酸 盐 ( AAP H ) 等 的 方 法 一 直 受 到 一 些 专 家 的 质 疑 与 羟 基 自由 基 不 同 的 是 这 些 自 由基 对 生 物 体 系 来 说 都 是 外 源 性 的 。但 对 于 食 品 体 系 来 说 ， 内部 的 组 成 成 份 复 杂 ， 测 定 清 除 不 同来 源 的 自 由基 的 能 力 对 今 后 应 用 于 食 品 中 具 有 较 好 的 理 论 和 实 际 意 义 加 入 保 加 利 亚 - L T - T - 菌 DP P H清 除 活 性 增 加 1 8 8 ( 图2 ) 发 酵时 间 h 图2 发酵时间对保加利亚乳杆菌清除DP P H的影响 2 3金 属 离 子 螯 合 能 力 图 3 为 发 酵 时 间 对 保 加 利 亚 乳 杆 菌 螯 合 铁 离 子 和 螯 合 铜 离 子 的 影 响 。 80 芝 7 5 7 0 6 5 掷 60 5 5 0 2 4 6 8 10 1 2 1 4 16 1 8 20 22 2 4 发 酵时 间 h _ 铜离子螯合能力； 铁离子螯合能力 图3 时 间对菌螯合铁离子和螯合铜离子 的影响 如 图 3 可 以 看 出 ， 保 加 利 亚 乳 杆 菌 的 加 入 改 善 了 酸 乳 清 水 解 物 螯 合 金 属 离 子 的 能 力 螯 合 亚 铁 和 铜 离 子 的 能 力 分 别 达 到 5 5 4 和 7 5 6 比未 加 前 提 高 了 3 7 和 1 7 4 。还 有 其 他 乳 酸 菌 具 有 金 属 离 子 螯 合 能 力 的 报 道 。保 加 利 亚 乳 杆 菌 KCTC3 0 9 9 鼠李 糖 乳 杆 菌 GG 和 肠 膜 乳 杆 菌( L a c t o b a c i l l u s m e s e n t e r o i d e s ) KCTC 3 1 0 0表 现 出螯 合 金 属 离 子 的 能 力 其 中保 加 利 亚 乳 杆 菌 KCTC3 0 9 9 螯 合 能 力 最 强 这 也 可 以 解 释 为 什 么 这 种 菌 可 以耐 受 较 高 的 氧 水 平 。 2 4抑 制 脂 类 氧 化 乳 清 水 解 物 可 以 通 过 以 下 几 种 方 式 抑 制 脂 类 氧 化 ： 清 除 自 由基 、 螯 合 金 属 离 子 和 减 少 氢 过 氧 化 物 等 。 氢 过 氧 化 物 和 丙 二 醛 是 脂 类 氧 化 的 初 级 和 二 级 产 物 具 有 潜 在 的 毒 害 作 用 ， 可 以 损 害 蛋 白 质 和 DNAp 6 1 7 。 脂 类 氧 化 产 物 可 以 使 食 品 品 质 变 劣 乳 清 水 解 物 能 够 抑 制 脂 类 氧 化 ， 抑 制 能 力 与 蛋 白质 的 水 解 度 有 关 水 解 可 以 释 放 更 多 的 活 性 氨 基 酸 残 基 以 阻 止 不 饱 和 脂 掣 蜒 如栅 艇 加 们 加 加 0 Re s e a r c h P a p e r s 研究报告 肪 酸 的 氧 化 。 通 常 高 组 氨 酸 和 疏 水 性 氨 基 酸 含 量 有 助 于 乳 清 蛋 白抑 制 脂 类 氧 化 。 保 加 利 亚 乳 杆 菌 发 酵 由 胰 凝 乳 蛋 白 酶 水 解 的 乳 清 可 以 延 迟 亚 油 酸 的 过 氧 化 使 亚 油 酸 氧 化 抑 制 率 达 到 5 0 9 ， 提 高 了2 0 7 。 与 B HT相 比 。 在 发 酵 初 始 阶 段 。 发 酵 液 的 抗 氧 化 活 性 比 较 低 ， 这 与 保 加 利 亚 乳 杆 菌 活 细 胞 的 数 量 低 一 致 。在 1 6 - 2 0 h。 发 酵 液 抑 制 亚 油 酸 氧 化 的 能 力 迅 速 增 高 ， 在 2 0 h 后 ， 抑 制 率 高 于 BHT。 Ah o t u p a 等 人 发 现 鼠 李 糖 乳 杆 菌 在 体 外 可 以 抑 制 脂 类 氧 化 。 因 为 菌 株 具 有 螯 合 铁 离 子 和 清 除 超 氧 阴 离 子 的 能 力 。L i n 等 人 7 1 证 实 长 双 歧 杆 菌 ATCc 1 5 7 0 8 I 嗜 酸 乳 杆 菌 ATCC4 3 5 6 可 以抑 制 亚 油 酸 过 氧 化 抑 制 率 可 以 达 到 2 8 O o 4 8 L i n g 人 【 发 现 酸 奶 中 1 1 株 菌 ( 1 0 s 菌 数 ) 的 抗 氧 化 活 性 与 ( 2 5 9 6) 1 0 - s BHT相 当 ， 这 一 含量 高于通 常在 食 品 中使 用 的浓 度 。保加 利亚 发酵 乳 清水解 液 的抗 氧化 活性高 于9 x1 0 - s 的BHT说 明这 种 发 酵 液 应 用 于 食 品体 系 中 可 以 有 效 抑 制 脂 类 氧 化 图 4 发 酵 时 间 对 保 加 利 亚 乳 杆 菌 抑 制 脂 质 氧 化 的 影 响 瓣 啦 嚣 0 2 4 6 8 10 1 2 1 4 1 6 18 20 22 2 4 发 酵 时 间 h 保 加 利 亚乳 杆 菌 ； B H T 图4 时间对菌抑制脂质氧化的影响 3 结 论 ( 1 ) 保加 利 亚乳 杆 菌可 以显 著 改善 乳 清水 解 物 的 抗 氧 化 活 性 。 清 除 羟 基 自 由基 活 性 、 清 除 DP P H活 性 、 螯 合 铁 和 铜 离 子 的 能 力 和 抑 制 亚 油 酸 过 氧 化 率 分 别 提 高 了 1 1 9 。 1 8 8 ， 3 7 ， 1 7 4 和 2 0 7 。 ( 2 ) 活 菌 数 对 抗 氧 化 活 性 有 影 响 ， 抗 氧 化 活 性 随 活 菌 数 的 变 化 而 变 化 。 发 酵 2 0 h 后 ， 乳 清 水 解 物 抑 制 亚 油 酸 过 氧 化 的 能 力 超 “x9 x1 0 - s 的BHT 可 以有 效 抑 制 脂 类 氧 化 。 参 考 文 献 ： 1 HA RMAN D Ag i n g ： a Th e o r y B a s e d o n F r e e Ra d i c a l a n d Ra d i a t i o n C h e mi s t r y J J G e r o n t o l ， 1 9 5 6 ， 1 1 ( 3 ) ：2 9 8 3 0 0 【 2 】S A UT E G RACL A M T， F R ANKE L E N， RA NG AV A J HYA L A N， e t a1 L a c t o f e r r i n i n I n f a n t F o r mu l a s ：E ff e c t o n Ox i d a ti o n 】 J o u r n a l o f Ag r i c u hn a n d F o o d C h e mi s t r y ， 2 0 0 0 ， 4 8 ( 1 o 1 ： 4 9 8 4 4 9 9 0 【 3 13 RI V AL S G， BOE RI O C G， W I CHE RS H J Cas e i n s a n d C a s e i n Hy d r o ly s a t e s 2 An t i o x i d a t i v e P r o p e r t i e s an d Re l e v an c e t o L i po x y g e - n R s e I n h i b i ti o n 田 J o u n a l o f A g r i c u l tur a l and F o o d C h e mi s t r y ， 2 0 0 1 ( a ) ， 4 9 ( 1 ) ： 2 9 5 - 3 0 2 4 1 P E N A RAMOS E A， XI ONG Y L A n ti o xidati v e A c ti v i t y o f wh t -y P r o t e i n Hy d r o l y s a t e s i n a L i p o s o ma l S y s t e mJ J Da i ry S c i ， 2 0 0 1 ， 8 4 ( 1 2 ) ： 2 5 7 7 2 5 8 3 【 5 】T ONG L M， S A S A KI S ， Mc CI 卫Ml匝NTs D J ，e t a1 A n t i o x i d a n t A c ti vity o f W h e y in a S a l mo n Oi l E mu l s i o n 】 J o u r n o fF o o d S c i e n c e ， 2 0 0 0 ， 6 5 ( 8 ) ： 1 3 2 51 3 2 9 6 S MI RONF F N， CUMB E S Q J H y r o x y l Ra dic a l S c a v e n g i n g Ac t i vit y o f C o mp a ti b l e S o l u t e s町 P h y t o c h e mis t r y ， 1 9 8 9 ， 2 8 ( 4 ) ： 1 0 5 7 1 0 6 0 7 】L I N M Y ， CHA NG F J An t i o xid a t i v e E ff e c t o f I n t e s t i n a l B a c t e r i a B ifi - d o b act e r i u m L o n g u m ATCC1 5 7 0 8 a n d L c 0 6 4 d l lu s Ac id o p h il u s A TCC 4 3 5 6 U Di g e s ti v e Di s e as e s and S c i e n c es，2 0 0 0 ，4 5 ( 8 ) ：1 6 1 7 1 6 2 2 8 】8 P E NG X Y， K ONG B H， XI A X F ， e t a1 Re d u c i n g and Ra d i c a l S c a v e n g i n g Ac ti viti es o f W h e y P r o t e i n Hy d r o l y s a t e s P r e p a r e d wi d l Al c a h s e叩 I n t e rna ti o n a l Dai r y J o u r n a l ， 2 0 1 0 ， 2 0 ( 5 ) ： 3 6 0 3 6 5 【 9 】AHOT UP A M， S A XE L I N M， K OR P E L A R A n t i o x i d a ti v e P r o p e r - ti es o f L a c t o b a c il l u s GG U Nu t r i ti o n To d a y ， 1 9 9 6 ， 3 1 ( 6 ) ： 5 1 S 一5 2 S 【 1 0 AT HI NA A A，S MI D E J ， B E NNI K M H J ， e t a 1 A n t i o x i dati v e Pr o pe r t i e s o f La ao b a c il l u s S d k Up o n Ex p o s u r e t o El e v a t e d Ox y g e n C o n c e n t r a ti o n s 】 F E MS Mi c r o b i o lo g y L e t t e r s ， 2 0 0 1 ， 2 0 3 ( 1 ) ： 8 7 9 4 1 1 】KUL L I S A A R T ， Z I L ME R M， MI KE L S AA R M， e t a 1 T wo An t i o x i d a t i v e L a c t o b a d ll i S t r a i m as P r o mi s i n g P r o b i o t i c s 】 I n t e r n a ti o n a l J o u r n a l o f F o o d Mi c r o b i o l o gy， 2 0 0 2 ， 7 2 ( 3 ) ： 2 1 5 2 2 4 【 1 2 RE E S J F ，P I RT S J T h e S t a b i l i ty o f L a c t Ad d P r o d u c o n i n Re s t i n g S u s p e n s i o n s o f L a c t o b a c i l l u s De lb me e c k i i 】 J o u r n a l o f Ch e mi c a l T e c h n o l o gy and B i o t e c hno l o g y ， 1 9 7 9 ， 2 9 ( 9 ) ： 5 9 1 5 9 6 【 1 3 】KuL L I s A A R T ，s oNGI S E P P E， MI KE L S A A R M， e t a1 A n t i o x - i d a t i v e P r o b i o t i c F e r me n t