生产管理知识_亚麻酸及其分子遗传学的研究论文

南开大学 博士学位论文 深黄被孢霉发酵生产-亚麻酸及其分子遗传学的研究 姓名：李明春 申请学位级别：博士 专业：微生物学 指导教师：邢来君;耿运琪 2000.4.1 南开大学博士研究生毕业论文中文摘要 中文摘要 f 深黄被孢霉( M o r t i e r e l l a i s a b e l l i n a ) 是毛霉目中具有重要经济价值的丝状真菌， I 碣其产生Y 一亚麻酸( Y L i n 0 1 e 1 3 i Ca c i d ，G L A ) ，而Y 一亚麻酸作为人体必需 的不饱和脂肪酸，对人体的激素调节及脂肪酸代谢发挥着重要的生理作用，尤其 它在心血管疾病、糖尿病以及癌症等方面的医疗价值而成为学术界研究的热点。 本文对深黄被孢霉生产y 一亚麻酸的发酵工艺，深黄被孢霉染色体的数目和基因 组大小，及其Y 一亚麻酸合成中的关键酶6 _ 脂肪酸脱氢酶基因的克隆和序列 分析进行了研究。 本实验室通过筛选、育种、小试工作已选育出一株产Y 一亚麻酸的菌株深黄被 孢霉批。，为了提高该菌株的产量性状，本文利用原生质体紫外线诱变的方法， 对M 。菌株进行了诱变筛选，从中筛选出了删。、M H ，。和删。三株诱变株，在菌体 二重、出油率和Y 一亚麻酸含量上都优于出发菌株。对高产Y 一亚麻酸菌株M H 2 3 进行了中试发酵，分别采用一级发酵、二级发酵和一级发酵中问补糖三种方式进 行了三批次5 0 0 立升罐体的发酵试验，结果三种发酵方式每升发酵液获得的Y 一 哑麻酸含量分别为1 1 9 4 m g 、1 0 5 5 m g 和8 6 3 m g ；利用2 5 吨罐进行了两批次扩大发 酵试验，Y 一亚麻酸含量分别达到1 1 7 4 m g L ，1 2 0 2 m g L 。并对Y 一亚麻酸的提取 和分离纯化工艺进行了研究，将实验室中用正己烷和乙醇分步抽提的工艺改为用 6 溶剂一步抽提技术，从而简化了生产工艺，降低了生产成本：采用脲素包合法， 以甲醇作为溶剂，温度控制在7 5 8 0 。C ，包合时间为3 h ，对中试发酵所提取的菌 油进行了浓缩，Y 一亚麻酸两次包合后，G L A 含量达到8 4 2 5 ，比原浓度浓缩了 近十二倍。本实验结果达到了国内同类研究的领先水平，为今后进一步工业化生 产奠定了基础。卜o 卫 ( 国内外对深黄被孢霉的研究主要集中在其实际应用方面，而对其遗传学和基 阎水平上的研究报道较少 本文剂用脉冲凝胶电泳C H E F 系统首次确定了被孢霉属 中产G L A 的深黄被孢霉A S 3 3 41 0 ( M o r t i e r e l l ai s a b e l l i n aA S 33 4 1 0 ) 及其诱变株也_ 2 2 、 I H 2 3 以及不产G L A 的拉曼被孢霉A S 3 3 4 1 3 ( M o r t i e r e l l ar a m a n n i a n aA S 33 4 1 3 ) 和 葡酒色被孢霉A S 3 3 4 1 4 ( M o r t i e r e l l av i n a c e aA S 33 4 1 4 ) 的染色体数目及基因组大 小。料每被孢霉菌丝体在2 溶壁酶和4 蜗牛酶溶液中，3 0 处理4 h ，收集原生质体， 调整原生质体浓度在2 1 0 8 个m l 左右，经低熔点琼脂糖包埋后，于含2 m g m l 蛋 白酶K 的N D S 溶液中酶解4 8 h ，制备成适于电泳的样品块。在脉冲电泳条件：O8 胶浓，缓冲液0s T B E ，脉冲间隔时间1 2 0 S ，电压5 3 v c m ，电泳时间1 2 h ，然后 脉冲间隔时间1 8 0 s ，电压5 3 v c m ，电泳时间1 2 h 。深黄被孢霉A S 3 3 4 i 0 及其诱 变株具有相同的染色体D N A 分子数目和大小，分离出1 5 条染色体带，以啤酒酵母 Y N N 2 9 5 染色体D N A 分子量为标准，估计其大小约为( k b ) ：2 6 6 0 、2 4 0 0 、2 2 5 0 、1 9 9 0 、 南开大学博士研究生毕业论文中文摘要 】8 2 0 、1 7 6 0 、1 6 3 0 、i 4 2 0 、1 3 4 0 、1 1 6 0 、8 6 0 、7 6 0 、6 8 0 、5 2 0 、3 9 0 ；拉曼被孢霉 A S 3 3 4 1 3 分离出1 0 条染色体带，大小约为2 4 3 0 、2 2 8 0 、1 9 1 0 、1 7 0 0 、1 6 0 0 、1 4 2 0 、 l2 8 0 、11 0 0 、9 3 0 、3 9 0 ；葡酒色被孢霉A S 3 3 4 1 4 分离出11 条染色体带，大小约 为2 6 6 0 、2 4 1 0 、2 1 6 0 、2 0 8 0 、1 9 2 0 、1 6 8 0 、1 6 2 0 、1 5 0 0 、1 4 4 0 、1 1 2 0 、1 0 8 0 。三 种被孢霉基因组大小分别约为2 1 6 4 0 k b 、1 5 0 4 0 k b 、1 9 6 7 0 k b 。通过比较三种被孢霉 的电泳核型，显示出染色体种间的特异性带型，提供了被孢霉基因组结构的基本 信息，经联网检索，国内外未见相同或相似的报道。L 一。 本文在研究深黄被孢霉基因组结构的基础上，进一步对Y 一亚麻酸代谢过程 中的关键酶6 一脂肪酸脱氢酶在基因水平上进行了研究。6 _ 脂肪酸脱氢酶 是以亚油酸( c 1 8 ：2 “”) 为底物，在C 6 和q 位之问脱氢形成Y 一亚麻酸( C 1 8 ：3 A “) ，克隆到该基因对提高G L A 产量，进行基因工程菌的构建和转基因植物具有 重大意义。本论文将已发表的高等植物、动物、蓝细菌、真菌的5 - 脂肪酸脱氢酶 序列进行同源性比较，发现6 一脂肪酸脱氢酶具有三个组氨酸保守区，但与其它位 点的脂肪酸脱氢酶不同的是，A 6 一脂肪酸脱氢酶在N 端特有细胞色素b ；( C y t b ；) 区，因此，我们根据C y t b ；区的H P G G 和组氨酸保守区I I IQ I E H H L F P 的氨基酸序列设 汁引物，提取深黄被孢霉的总R N A ，进行R T - P C R 扩增，将扩增出的D N A 片段进行 连接、转化，最后对重组质粒进行酶切鉴定和测序。f 结果表明深黄被孢霉L 脂肪 酸脱氢酶H P G G 区与I I I 区之间的c D N A 片段长度为1 0 7 1 个核苷酸，编码3 5 7 个氨基 酸，与己报道的高山被孢霉6 一脂肪酸脱氢酶基因具有9 4 9 6 的同源性，而与其它物 种如蓝细菌、玻璃苣、小鼠、线虫的6 _ 脂肪酸脱氢酶同源性很低，氨基酸序列的 最大同源性在3 0 左右，核苷酸序列的最大同源性在5 0 左右。在此基础上，又对 吐脂肪酸脱氢酶结构基因进行了克隆和序列分析，得到了全长为1 3 7 卑b p 核苷酸 序列，编码4 5 7 个氨基酸，这是国际上对深黄被孢霉6 _ 脂肪酸脱氢酶基因的首次 报道卫“ 螺王两童菽，本j 垒文在研究深黄被孢霉生产G L A 的发酵工艺基础上，对该菌株 进行了电泳核型分析，首次报道了其染色体数目和基因组大小，并对产Y 亚麻 酸的关键酶一一5 _ 脂肪酸脱氢酶基因进行了克隆和序列分析，为更深入细致地研 究被孢霉中脂肪酸脱氢酶系统的分子遗传学，揭示产生G L A 的调控机制打下了坚 实的摹础。附今后基因工程菌株的构建和转基因植物的研究具有重 和实际的应用价值0 一“；足一， 一 够 关键词： 深黄被孢霉，y 一亚麻酸，发耐，蘧蚕珥囊霾是国，电 体D N A ，6 _ 脂肪酸脱氢酶基因，反转录聚合酶链式反应， 析瘪遣傅蟮， 要的理论意义 泳核型，染色 克隆，序列分 南开大学博士研究生毕业论文英文摘要 A B S T R A C T T h ef i l a m e n t o u sf u n g u s ，M o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ，b e l o n g i n gt ot h eM u c o r a l e s ，i so f g r e a tv a l u e i n e c o n o m ya s i t p r o d u c e s Y l i n o l e n i ca c i d ( G L A lG L Ai so n eo ft h e e s s e n t i a lu n s a t u r a t e df a t t ya c i df o rh u m a nb o d ya n dp l a y si m p o r t a n tp b y s i o l o g i c a lr o l e si n b o t ht h eh o r m o n a lr e g u l a t i o na n df a t t ya c i dm e t a b o l i s ma n de s p e c i a l l yi nt h et r e a t m e n to f c a r d i o v a s c u l a rd i s o r d e r s ，d i a b e t e s ，c a n c e ra n dS Oo nT h e r e f o r e ，t h i sf u n g u sh a sS Of a r b e c o m et h e p r i n c i p a l f o c u so fr e s e a r c h e si nt h ea c a d e m i cc i r c l e s T h i st h e s i s m a i n l y i n d i c a t e st h es t u d yo nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fM i s a b e l l i n ap r o d u c i n gY l i n o l e n i c a c i d ，t h en u m b e ro ft h ec h r o m o s o m e sa n dt h es i z eo fg e n o m eo fM i s a b e l l i n a ，a n dt h e c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so f t h ek e ye n z y m e 6 一f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ei n G L A s y n t h e s i s O n es t r a i no fY l i n o l e n i ca c i d p r o d u c i n gM i s a b e l f i n aI V l 6 2 2h a sb e e no b t a i n e di n o u rl a b o r a t o r yv i as c r e e n i n g ，b r e e d i n ga n das m a l l - s c a l et e s tI no r d e rt Oi m p r o v et h ey i e l d c h a r a c t e ro ft h i ss t r a i n ，p r o t o p l a s t - - u l t r a v i o l e tr a ym u t a g e n e s i sm e t h o dw a sa d o p t e dt o m a k eMi s a b e l l i n aM 6 2 2p r o d u c ed e r i v a t i v em u t a n t s W eo b t a i n e dt h r e em u t a n ts t r a i n s ： M H 2 3 ，M H l 8a n dM I - 1 2 6 ，w h i c hw e r e f a rb e t t e rt h a nM 6 2 2i nt h ed r yc e l lw e i g h t ，r a t eo f l i p i d p r o d u c t i o na n dc o n t e n to fG L AI n am e d i u m s c a l et e s t ，M i s a b e l l i n aM H 2 3 ，am u t a n to f h i g hy i e l d i n go fG L A ，w a sm a d e t Of e r m e n tr e s p e c t i v e l yu s i n gt h ef i r s ts t e pf e m e n t a t i o n ， t h es e c o n ds t e pf e r m e n t a t i o na n dt h ef i r s ts t e pf e r m e n t a t i o nd u r i n gw h i c hs u g a rw a sa d d e d i n5 0 0l i t e rf e r m e n t e r T h er e s u l tw a st h a tt h ec o n t e n t so fG L Ao b t a i n e di nt h et h r e ew a y s i ne a c hl i t r eo ft h ef e r m e n t e db r o t hw e r e11 9 4 m g ，1 0 5 5 m ga n d 8 6 3 m g ，r e s p e c t i v e l y ； a n o t h e re n l a r g e df e r m e n t a t i o nt e s tw a sm a d ei nt w ob a t c h e si na2 5 - t o nf e r m e n t e Kt h e r e s u l to fw h i c hw a st h a tt h ec o n t e n t so fG L Ac a m et oI17 4 m g La n d 12 0 2 m g L ， r e s p e c t i v e l y I na d d i t i o n ，af u r t h e rs t u d yw a sm a d eo ft h et e c h n i q u eo fe x t r a c t i o n , i s o l a t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fG L AT h ef a c t i o n a le x t r a c t i o nu s e di nt h el a b o r a t o r yw i t hn h e x a n ea n d e t h a n o lw a sc h a n g e di n t ot h ew h o l ee x t r a c t i o no f6 “s o l v e n t ，w h i c hs i m p l i f i e dp r o d u c t i o n t e c h n i q u ea n dr e d u c e dc o s to fp r o d u c t i o n T h e f u n g a ll i p i de x t r a c t e df r o m t h ef e r m e n t a t i o n i nt h em e d i u m s c a l et e s tw a sc o n c e n t r a t e db yt h eu r e aa d d u c t i n gm e t h o dw i t hm e t h a n o la s s o l v e n t ，a t7 5 - 8 0 “ C f o r3h o u r sA f t e rG L Ah a db e e na d d u c t e dt w i c e ，t h ec o n t e n to f G L A c a m eu pt O8 42 5 ，a r o u n dat w e l f t ha sm u c ha st h eo r i g i n a lc o n c e n t r a t i o nT h er e s u l t s o b t a i n e di no u r l a b o r a t o r yh a v ec o m eu pt ot h ea d v a n c e dl e v e l si nt h es a m e a r e ai nC h i n a 南开大学博士研究生毕业论文英文摘要 a n dl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rt h el i n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o n P r e v i o u s l y , r e s e a r c h e so fM o r t e 舢a i s a b e l l i n a a r e m a i n l yc o n c e n t r a t i n g o ni t s p r a c t i c a la p p l i c a t i o n , b u tl i t t l eh a sb e e nr e p o r t e do n t h es t u d yo fi t sg e n e t i c sa n d g e n e l e v e l W eh a v ef o rt h ef i r s tt i m ee m p l o y e dt h eC H E Fs y s t e m ( C o u t o u r c l a m p e dh o m o g e n e o u s e l e c t r i cf i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ) t oi d e n t i f yt ot h en u m b e ro f t h ec h r o m o s o m e sa n dt h es i z e o fg e n o m eo fM o r t i e r e l l ai s a b e l l i n aA S33 4 1 0a n di t sm u t a n t sM 6 2 2a n dM H 2 3w h i c h p r o d u c eG L Aa s w e l la sM o r t i e r e l l ar a m a n n i a n aA S 3 3 4 1 3a n dM o r t i e r e l l av i n a c e a A S 33 4 1 4w h i c hd o n t p r o d u c e G L AT h e s a m p l ep i e c e sa p p l i c a b l e t ot h eC H E F e l e c t r o p h o r e s i sw e r em a d eb yh a n d l i n gM o r t i e r e l l am y c e l i ai n2 l y w a l l z y m ea n d4 s n a i l a s ea t3 0 “ Cf o r4h o u r s ，g a t h e r i n gt h ep r o t o p l a s t sa n da d j u s t i n gt h e i rc o n c e n t r a t i o nt o 2 10 5 m lo rs oa n de m b e d d i n gt h e p r o t o p l a s t s i nt h el o wm e l t i n gp o i n t a g a r o s ea n d e n z y m a t i c a l l yt r e a t i n g t h ea g a r o s e - e m b e d d e d p r o t o p l a s t s w i t hN D Sc o n t a i n i n g2 m g m l p r o t e n a s eK f o r4 8 hW e c a r r yo u tC H E Fe l e c t r o p h o r e s i so f M o r t i e r e l l au n d e rc o n d i t i o n so f O8 a g a r o s eg e li nO5 T B E ，53 W c m ，ap u l s es w i t c h i n gi n t e r v a l o f1 2 0 sf o r 1 2 h ， f o l l o w e db y53V c m ，1 8 0 sf o r1 2 ha t1 4 。CT h er e s u l t sr e v e a l e dM i s a b e l l i n aA S 33 4 1 0 a n dR 。sm u t a n t sa r ei d e n t i c a li nt h en u m b e ra n ds i z eo ft h ec h r o m o s o m a lD N Am o l e c u l e s T h e i rc h r o m o s o m a lD N A sh a v eb e e nr e s o l v e di n t ol5b a n d s a n dc h r o m o s o m a lD N A s f r o mS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eY N N 2 9 5a r eu s e da st h em o l e c u l a rs i z er e f e r e n c em a r k e r s ， t h e i rs i z e sa r ee s t i m a t e dt ob ea p p r o x i m a t e l y ( k b ) ：2 6 6 0 ，2 4 0 0 ，2 2 5 0 ，1 9 9 0 ，1 8 2 0 ，1 7 6 0 ， 16 3 0 ，1 4 2 0 ，1 3 4 0 ，11 6 0 ，8 6 0 ，7 6 0 ，_ 6 8 0 ，5 2 0a n d 3 9 0 ；1 0c h r o m o s o m a lb a n d sf r o m M o r t i e r e l l ar a m a n n i a n aA S 33 4 1 3a r ea p p r o 撕m a t e l y ( k b ) ：2 4 3 0 ，2 2 8 0 ，1 9 1 0 ，1 7 0 0 ，1 6 0 0 ， 1 4 2 0 ，1 2 8 0 ，1 1 0 0 ，9 3 0a n d3 9 0 ；llc h r o m o s o m a lb a n d sf r o mM o r t i e r e l l av i n c l c e aA S 33 4 1 4 a r ea p p r o x i m a t e l y ( k b ) ：2 6 6 0 ，2 4 1 0 ，2 1 6 0 ，2 0 8 0 ，1 9 2 0 ，1 6 8 0 ，1 6 2 0 ，1 5 0 0 ，1 4 4 0 ，1 1 2 0a n d 1 0 8 0T h e g e n o m es i z e so f t h et h r e e M o r t i e r e l l aa r ea p p r o x i m a t e l y2 1 6 4 0k b ，1 5 0 4 0 k ba n d I 9 6 7 0 k b ，r e s p e c t i v e l yE l e t r o p h o r e t i ck a r y o t y p e o ft h r e eM o r t i e r e l l a s p e c i e s s h o w e d s p e c i e s - s p e c i f i cc h r o m o s o m eb a n d i n gp a t t e r n s T h i ss t u d yp r o v i d e dt h eb a s i ci n f o r m a t i o n a b o u tt h ec o n s t i t u t i o no f t h en u c l e a r g e n o m e o f M o r t i e r e l l a R e t r i e v i n gi ni n t e r n e t ，w eh a v e n e v e rf o u n d a n yo f t h es a m e o rs i m i l a rr e p o r t so nt h i sm a t t e ri i nt h ew o r l d B a s e do nt h er e s e a r c ho ft h eg e n o m es t r u c t u r eo f M i s a b e l l i n a ，af u I r t h e rs t u d yh a s b e e nm a d eo f t h e k e ye n z y m e 6f a t t ya c i dd e s a t u r a s ei nt h em e t a b , l o l i cp r o c e s so f G L A a ti t s g e n el e v e l ，y L i n o l e n i ca c i d ( C 1 8 ：3 A6 ，9 ，1 2 ) i ss y n t h e s i z e db y 6 - f a t t ya c i d d e s a t u r a s eu s i n gl i n o l e i c a c i d ( C 1 8 ：2 A 9 1 2 1 a s as u b s t r a t eb yd e h y d r o g e n a t i o nb e t w e e n 南开大学博士研究生毕业论文 英文摘要 c a r b o n6a n d7 I fi ti sc l o n e dt ot h eg e n e ，t h a ti so fg r e a ts i g n i f i c a n c et oc o n s t r u c t i o n g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e ds t r a i na n dt r a n s g e n i cp l a n t sC o m p a r i s o no f t h ed e d u c e da m i n o a c i ds e q u e n c e so ft h ep u b l i s h e d 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s ef r o mh i g h e rp l a n t s ，m a m m a l s ， c y a n o b a c t e f i aa n df u n g ir e v e a l e dt h a t 6 - f a t t y a c i dd e s a t u r a s ec a r r i e st h r e eh i s t i d i n e h i g h l yc o n s e r v a t i o nr e g i o n s ，b u tt h ed i f f e r e n c ef r o mt h ef a t t ya c i dd e s a t u r a s e so nt h eo t h e r p o s i t i o ni s t h a t A 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ec o n t a i n saN - t e r m i n a lc y t o c h r o m eb 5d o m a i n T h e r e f o r e ，w ed e s i g n e dp r i m e r sb a s eo nt h es e q u e n c e so ft h eH P G G i n C y t b 5a n dt h e h i s t i d i n ec o n s e r v a t i o n r e g i o n I I I Q I E H H L F P T h e p r i m e r s w e r eu s e df o rP C R a m p l i f i c a t i o no fc D N A r e v e r s et r a n s c r i b e df r o mt o t a lR N Ao fM i s a b e l l i n a T h eP C R a m p l i f i e dD N Af r a g m e n t sw e r ep u r i f i e d ，l i g a t e di n t op G E M - Tv e c t o r , a n dt r a n s f o r m e di n t o E c o l iJ M l 0 9c e l l F i n a l l y , t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw e r ei d e n t i f i e da n ds e q u e n c e d T h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h ee D N A f r a g m e n to f M i s a b i l l i n a 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eb e t w e e n t h eH P G Ga n dI I I Q I E H H L F Pw a s1 0 7 1 b pe n c o d i n g3 5 7 A ai nl e n g t h ，a n dM i s a b e l l i n a s h o w e d9 4 i d e n t i t yw i t hM a l p i n a 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e w h e r e a si t e x h i b i t e dl o w e r i d e n t i t yw i t ht h e x 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s eo ft h eo t h e ro r g a n i s m ss u c ha sS y n e c h o c y s t i s ， B o r a g eo f f i c i n a l i s , R a ta n dC a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ，a n d3 0 o r s oi d e n t i t yw i t ht h ea m i n o a c i ds e q u e n c e sa n d5 0 o r S Oi d e n t i t yw i t ht h en u c l e o t i d es e q u e n c eO nt h i sb a s i s ，w e f u r t h e rc l o n e dt h e X 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s es t r u c t u r a lg e n eo f M i s a b e l l i n aa n do b t a i n e d t h ef u l l - l e n g t h ，1 3 7 I b p ，o ft h en u c l e o t i d es e q u e n c ee n c o d i n g4 5 7a m i n oa c i d sT h i si st h e f i r s tr e p o r tt h a t 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ef r o m M i s a b e l l i n aw a sc l o n e di nt h ew o r l d T os u mu p ，b a s e dO t lt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fM i s a b e l l i n ap r o d u c i n gG L A ，w e h a v es u c c e e d e di ne l e c t r o p h o r e t i ck a r y o t y p ea n a l y s i so ft h i ss t r a i n ，a n dh a v er e p o r t e dt h e n u m b e ro fi t sc h r o m o s o m ea n dt h es i z eo fi t sg e n o m eM o r e o v e LW eh a v ea c h i e v e dS u C c e s s i nt h ec l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so ft h ek e ye n z y m e 一6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e o ft h e p r o d u c t i o n o fG L AA l lr e s u l t sm e n t i o na b o v eh a v el a i dt h ef o u n d a t i o no ft h e t h o r o u g hg o i n gr e s e a r c ho f t h em o l e c u l a rg e n e t i c so ft h ef a t t ya c i dd e s a t u r a s es y s t e mi n M o r t i e r e l l aa n dr e v e a l i n gt h er e g u l a t o r ym e c h a n i s mo ft h ep r o d u c t i o no fG L Aa n da r eo f g r e a tt h e o r e t i c a ls i g n i f i c a n c ea n dg r e a ta p p l i e dv a l u et ot h ef u r t h e rs t u d yo fg e n e t i c a l l y e n g i n e e r e ds t r a i na n dt r a n s g e n i cp l a n t s K e y w o r d s ：M o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ，Y L i n o l e n i ca c i d ，F e r m e n t a t i o n ，P u l s e d f i e l d g e l 旦翌兰生望生竺堕堑竺兰些兰苎一 叁奎塑墨 e l e c t o p h o r e s i s ，E l e c t r o p h o r e t i ck a r y o t y p e C h r o m o s o m a lD N A , A 6 _ f a t t ya c i d d e s a t u r a s e g e n e ，R e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( R T 。p c R ) ， C l o n i n g ，S e q u e n c ea n a l y s i s 南开大学博士研究生毕业论文第一章 第一章Y 一亚麻酸中试发酵的研究 一、前言 ( 一) y 一亚麻酸的发现历史及代谢路线 1 9 1 9 年，由L u f t 和H e i d u s h k a l l l 等从月见草的种子油中发现了一种新的脂肪酸， 即q 一亚麻酸( a - L i n o l e l i ca c i d ) 的同分异构体，命名为y 一亚麻酸( y L i n o l e l l i C i d ，G L A ) ，1 9 2 7 年，利用臭氧化降解反应测定其结构为6 ，9 ，1 2 一十八碳三烯酸”1 ， 直到1 9 4 9 年，正式确认Y 一亚麻酸为全顺式6 ，9 ，1 2 一十八碳三烯酸( A 1 1e i S6 ，9 ，1 2 一 O c t a d e c a t r i e n o i ca c i d ) 1 3 1 ，分子式为c 1 8 H 3 0 0 2 ，结构式为： y 一亚麻酸是人体一种必需脂肪酸( E s s e n t i a lf a t t ya c i d ，E F A s ) ，必需脂肪酸就 如同维生素一样，是一种营养元素，由于它不能由人体自身宣接合成，只能从食 物中获得，所以国外的许多临床研究称Y 一亚麻酸为维生素F 。y 一亚麻酸对人体而 言具有双重功能，既是人体的必需营养元素，同时又是治疗疾病的重要药物，其 代谢路线如图1 1 所示。 多烯不饱和脂肪酸( p 0 1 y u n s a t u r a t e df a t t ya c id ，P U F A ) 是指含有两个或 两个以上双键且碳原子数为1 6 至2 2 的直链脂肪酸，从碳链的甲基端原子开始， 根据第个双键在分子中所在的位置将P U F A 分为两类，即n 一6 ( 或u 一6 ) 和n 3 ( 或u 一3 ) “1 ，亚油酸是u 一6 及u 一3 两类的母体，在生物体中经一系列脱氢酶催 化和碳链延长而衍生成其它的P U F A 。由于人体缺乏在脂肪酸的第九位碳原子以上 位置引入不饱和双键的脱氢酶，所以人体自身不能合成亚油酸( L i n o l e i ca c i d ， L A ) 和Y 一亚麻酸( y - L i n O l e l l i ca c i d ，G L A ) ，需从食物中获取，因此，L A 、G L A 和A A ( 花生四烯酸，A r a c h i d o n i ca c l d ) ，被称为必需脂肪酸( E F A s ) 。机体内所有 膜的流动性和柔韧性都受到E F A s 组成的影响，而E F A s 在膜内的浓度和分子内的 双键数决定了膜的流动性。然而，有同样双键的n 一3E F A s 却不能逆转n - 6E F A s 造成的缺陷，因此，双键的构型必定是重要的“1 ，另外，E F A s 也影响到膜内许多 蛋白如离子通道、受体、A T P a s e 等的结构和功能”】。 必需脂肪酸至少有四个作用：( 1 ) 具有调节细胞膜结构的作用；( 2 ) 是生物活 性物质如前列腺素、自三烯、过氧羟基脂肪酸的前体；( 3 ) 控制皮肤水分的不渗 透性及胃肠道和血脑屏障细胞膜的渗透性；( 4 ) 调节胆固醇的运输和合成。 堕堑查兰苎圭堕塑竺兰些堡茎丝二兰 ( 1 1 6E F A s ) 6 脱 C 1 8 ：0 硬脂酸 ( S t e a r i ca c i d ) h 。脱氢酶( 2 H ) 9 - C 1 8 ：1 油酸 ( O l e i ca c i d ) 0A 1 2 脱氢酶( 一2 H ) A9 ，1 2 一C 1 8 ：2 亚油酸 ( L i n o l e i Ca c i d L A ) 氢酶( 删) 矿 A6 ，9 ，1 2 一C 1 8 ：3Y 一亚麻酸 ( Y L i n 0 1 e n i Ca c i d G L A ) 延长+ 2 C P G - 类+ A5 ，8 ，1 1 - C 2 0 ：3 二高y 亚麻酸 ( D i h o m o I 环氧酶、I P G 2 一 f 弋 P G D 2P G F ：P G J ： y L i n o l e n i ca c i d D 6 L A ) A5 脱氢酶( 一2 H ) A5 ，8 ，1 1 ，1 4 一C 2 0 ：4 花生四烯酸 ( A r a c h i d o n i ca c i d 从) 目l 氧I + 2 C 酶I ( n 一3E F A s ) 脱氢酶( 一2 H ) A 9 ，1 2 ，1 5 - C 1 8 ：3Q 亚麻酸 ( o L i n o l e n i Ca c i d ) 6 脱氢酶( 一2 H ) A6 9 1 2 1 5 一C 1 8 ：4 + 2 C A 8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 - C 2 0 ：4 I A t 脱氢酶( 2 H ) A 5 ，8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 - C 2 0 ：5 ( E i c o s a p e n t a e n o i c ，E P A ) 0 + 2 C ，A 5 _ 脱氢酶( 一2 H ) A47 1 0 1 3 1 6 1 9 一C 2 2 ：6 ( D