设备管理_组培设备及其条件

组培设备与条件开展植物组织培养工作需要一个比较合理实用的场所，一套适宜的设备和提供必要的实验环境条件，这是首先要考虑到的。根据科学、合理的原则，一个较为理想的配置应该包括： 1、化学药品室 2、配培养基室 3、灭菌室 4、接种室 5、无菌培养室 基本仪器设备与用品 1、仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅（手提式、立式或卧式）、小推车（可选）、精密电子天平（至少千分之一）、电子天平或托盘天平、酸度计、普通冰箱、烘箱、解剖镜、光照培养箱（选购）、电炉、微量可调移液器及配套吸嘴、移液管架、磁力搅拌器（可选）、不锈钢托盘、灌装机（可选）、培养架、定时器（控制光照时间）、紫外线杀菌灯、照度计（可选）、温湿度计（可选）蒸馏水器、摇床（可选）、针头滤器及配套滤膜2、小型用品 枪镊，弯剪、解剖刀、接种盘3、玻璃器皿 组培瓶（玻璃或塑料）、烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、移液管架、容量瓶、试管、酒精、玻璃棒、滴瓶4、组培药品 （详细药品请见常用配方）5、其他 吸耳球、刷子、记号笔、定时钟、手套、封口膜、卫生药棉、拖鞋、口罩、白大褂、滤纸、洗瓶培养条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、 PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育。 一、温度（temperature） 因为温度是植物组织培养中的重要因素，所以植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是在 2327 之间进行，一般采用 252。低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高于35时对植物生长不利。但是，不同植物培养的适温不同。白鹤非的最适温度是20、月季是2527、番茄是28。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好，在12以下，33以上形成率皆最低。 不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率比在25%以下的高。桃胚在2条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用35处理草莓的茎尖分生组织3d，可得到无病毒苗。 二、光照（light） 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面： 1、光照强度（light intensity） 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2、光质（light wave） 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 3、光周期（light period） 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗培养下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。 三、湿度（humidity） 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%-80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。 四、渗透压（penetrating pressure） 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。 五、PH值 不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（见表），大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多数植物培养的需要。不同植物的最适PH值 种类 最适 PH 值 种类 最适 PH 值 杜鹃4.0月季5.8越橘4.5胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆5.5桃7.0番茄、葡萄5.7 PH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高一些。一般来说PH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低PH值（约0.2-0.3个PH值）因此在配制时常提高PH值0.2-0.3单位。PH值大小调节可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调整。1ml的NaOH可使PH值升高0.2单位，1ml的HCl可使PH值降低0.2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。 六、气体（gas） 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。 培养基的成分 培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。自然状态下生长的绿色植物由于自身能进行光合作用，并且能合成植物生长发育所需的几乎所有有机成分，加上土壤中含有较全面的无机和有机营养成分，所以只需在适当的时候施加少量的无机和有机肥（复合成分），植物就可良好的生长。但是，在进行植物组织培养时，只是切取植物体的一小部分，它们无法合成生长发育所需要的全部物质，加上人们对植物体的各种组织和器官所需营养成分了解甚少，因此对培养基的组成成分的探索走过了一条十分艰苦而漫长的道路，至今人们还不能完全达到自主的阶段。在所报道的培养基中，没有任何一种培养基能够适合所有类型的植物组织和器官，也没有实现对所有的植物都能通过组织培养使其再生的目的。由于植物的多样性和生长环境的复杂性与多变性，也不可能有一种万能的培养基。目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。例如，White培养基是Uspenski和Uspenskaia（1925）的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养；Cautheret培养基是建立在Knop营养液（1865）基础上的。以后的培养基大部分是在White和Cautheret培养基的基础上改进而成。 就目前所使用的各种培养基而言，可将它们的成分划分为几大类， 1、 水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。 2、 无机营养成分（包括大量元素，微量元素和铁盐） 3、有机营养成分（包括维生素，氨基酸及其微生物等） 4、碳水化合物 5、植物生长调节物质（常称为激素） 6、 琼脂或其他支持物 7、 其他添加剂 （含天然提取物、抗生素等） 维生素B1（盐酸硫胺素）维生素 B2（核黄素）维生素 B6（吡多辛）维生素 C（抗坏血酸）维生素 E（生育酚）维生素 A（维生素甲、视黄醇）维生素 AD（鱼肝；由丸）阿发骨化醇芦丁 （维生素P）芦丁（维生素P）维生素 B6，盐酸吡哆醇 用途： 主要用于防治皮肤粗糙、粉刺、日光晒伤、止痒。也适用于防治脂溢性脱发、皮肤炎症、一般性痤疮，脂溢性湿疹和落屑性皮肤等化妆品制剂。可制成膏霜、乳液和醇溶液。一般与其他维生素配合使用。技术指标： 中文名称： 维生素 B6，盐酸吡哆醇 英文名称： Vitamin B6，Pyridoxin 化学名称： 6甲基5羟基3，4吡啶二甲醇盐酸盐质量指标：熔 点：205209鉴 别：本品的红外吸收图谱应与对照的图谱一致。酸 度：PH值应为2.43.0产品说明： 性 状： 白色或类白色的结晶或结晶性粉末；无臭，味酸苦；遇光渐变质。在水中易溶，在乙醇中微溶，在氯仿或乙醚中不溶。水溶液呈微酸性反应。吡哆醇是醇式维生素B6，是较稳定的一种结构，在酸性或碱性溶液中可耐热維生素 B1（鹽酸硫胺素） 作 用 主要用於防治缺乏維生素B1所致的腳氣病。也用於神經炎、心肌炎、消化不良輔助治療。甲狀腺機能亢進患者，妊娠或高熱患者，可適當補充維生素B1，以改善症狀。 罗纳普朗克动物营养公司的盐酸硫胺素（维生素B1）是盐酸铵素粉状产品，符合美国药典标准。组成: 化学式 C12H17C1N4OL HCI维生素B4 Vitamin B4（腺嘌呤，氨基嘌呤，Adeninephosphate）【性状】常用其磷酸盐，为白色针状结晶或结晶性粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚或氯仿。其饱和水溶液呈中性。【药理及应用】本品是核酸的组成成分，在体内参与RNA和DNA合成。当白细胞缺乏时，它能促进白细胞增生，一般用药24周左右，白细胞数目可增加。用于各种原因如放射治疗、苯中毒、抗肿瘤药和抗甲状腺药等引起的白细胞减少症，也用于急性粒细胞减少症。叶酸（维生素BC，维生素M）水溶性；维生素B族中的一种，亦称为维生素BC或维生素M； 计量单位是微克（mcg）； 是制造红血球不可缺少的物质； 帮助蛋白质的代谢。-生物素（d-biotin, 1）又名维生素H，属水溶性维生素B族。 d-生物素是转化酶的辅酶R，也是蛋白质和脂肪中间代谢中的一个重要辅酶，在维持人和动物正常生长发育，保护皮肤，羽毛和骨髓健康起着必不可少的作用。因而为医疗，多维制剂和饲料行业等方面得以广泛应用。生物素的补充物为右旋生物素（ D-生物素）制剂，纯品一般含 D-生物素98以上，是一种近白色结晶性粉末，在冷水中溶解度低，随水温升高其溶解度增加，但高温时稳定性受到影响，配制生物素溶液时，最适温度为50左右。生物素是稳定性较好的一种维生素，对氧化、还原、微量元素都很稳定，强酸、强碱、紫外线对生物素稍有影响，生物素对热敏感。D-生物素（维生素H）化学名称： D-Biotin（VITAMIN H）标准： USP24/BP98规格：医药级（ 99.0%）饲料级（2%）二四滴（ 2，4-dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D） 一种人工合成的具有与生长素类似生理效应的有机物。化学名称为2，4-二氯苯氧乙酸，合成过程简单，可以大量生产，在农业及园艺生产上已广泛应用。低浓度具有促进插枝生根，阻止器官脱落，形成无子果实等作用，如1015ppm（1ppm=10-6）溶液蘸花或喷洒花簇，即可得到无子果实；高浓度可杀死双子叶植物，作为单子叶植物小麦、玉米、高梁等田间的除草剂。吲哚丁酸 （IBA）和一种植物细胞分裂素：6苄基腺嘌吟（6BA）D-生物素/VH叶酸 /VBc萘乙酸简称，是一种植物生长调节剂，近年来在果树生产上应用十分广泛 .培养基的种类 培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。 培养基的产生最早是Sacks（1680）和Knop（1681），他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在40年代用得较多，现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基（简称MS培养基），也有对某些成分进行改良称作改良培养基。 目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下： （1）MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。 （2）B5培养基 是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 （3）White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO 4 的浓度和增加了鹏素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。 （4）N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO 3 和（NH 4 ）2SO 4 含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 （5）KM-80培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。 培养基的选择 1、选择合适的培养基 选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White培养基适合于根的培养。首先试用这些培养基进行初步实验，可以少走弯路，大大；减少时间、人力和物力的消耗。当通过一系列初试之后，可再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整。在进行调整时，以下情况可供参考。一是当用一种化合物作为氮源时，硝酸盐的作用比铵盐好，但单独使用硝酸盐会使培养基的PH向碱性方向漂移，若同时加入硝酸盐和少量铵盐，会使这种漂移得到克服。二是当某些元素供应不足时，培养的植物会表现出一些症状，可根据症状加以调整，如氮不足时，培养的组织常表现出花色苷的颜色（红、紫红色），愈伤组织内部很难看到导管分子的分化；当氮、钾或磷不足时，细胞会明显过度生长，形成一些十分蓬松，甚至呈透明状的愈伤组织；铁、硫缺少时组织会失绿，细胞分裂停滞，愈伤组织出现褐色衰老症状；缺硼时细胞分裂趋势缓慢，过度伸长；缺少锰或钼时细胞生长受到影响。培养基外源激素的作用也会使培养物出现上述一些类似的情况，所以应仔细分析，不可轻易下结论。2、激素浓度和相对比例的确定 组织培养中对培养物影响最大的是外源激素，在基本培养基确定之后，实验中要大量进行的工作是用不同种类的激素进行浓度和各种激素间相互比例的配合试验。在实验中，首先应参考已有的报道，看是否有用相同植物、相同组织或相近者做过成功或失败的试验，如果有则可直接作为参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择3-5个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案。 这样就设计出了16种激素配比的实验方案，即16种不同的培养基。用着16种培养基进行初试之后，你会找到1种或几种是比较好的。再在这些比较好的组合的基础上进行小范围的调整，设计出一组新的配方。如在表一中，您认为6号培养基较有希望，就可以在此基础上做出如表二的一组新的设计。表一 两种激素4种浓度的组合试验 浓度为 mg ? L -1细胞分裂素 0.51.5 3 4.5 生长素0 123 4 0.5 56 7 8 1.0 9 2.013 有 16种不同的培养基 表二 第二次激素配比实验 浓度为 mg ? L -1细胞分裂素 1.01.25 1.50 1.75 生长素0.251 234 0.55 678 0.75 有16种不同的培养基 一般来说，经过这次实验就可能选出一种适合于你的实验材料的培养基，或许不是最好的，但结果是可靠的。在此基础上可进行培养基中其他成分的变动实验，如可变动蔗糖浓度、琼脂用量、培养基的 PH或添加某些氨基酸等。但必须掌握一个原则，就是要有理有据，特别是对一些宝贵的植物培养材料，更要慎之有慎。 如果上述试验失败，那就要做一些更细致、更麻烦的实验，花费更多的时间、人力和物力，而且最好在专业人员的指导下进行，切莫根据想象来随意设计培养基，这样成功的概率极小，使宝贵的植物材料丢失，或失去时机。 培养基的配制 配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如 MS、B5等。 自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。1、配制几种母液 （1）配制MS大量元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取 NH 4 NO 3 165g KH 2 PO4 17g KNO 3 190g CaCl 2 2H 2 O 44g MgSO 4 7H 2 O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.025g H 3 BO 3 0.62g CuSO 4 5H 2 O 0.0025g MnSO 4 H 2 O 1.69g CoCl 2 6H 2 O 0.0025g ZnSO 4 7H 2 O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 CuSO 4 5H 2 O和CoCl 2 6H 2 O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO 4 5H 2 O 0.05g CoCl 2 6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。 （3）配制MS有机母液 一般配制成100倍MS有机母液。 依次称取 肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g 烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （4）配制MS铁盐母液 一般配制成100倍MS铁盐母液。 依次称取 EDTA二钠 3.73g FeSO47H2O 2.78g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。激素母液的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。2、配制培养基 以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作： （1）先在烧杯中放入一些蒸馏水。 （2）分别取上面八种母液10ml倒入。 （3）一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。 （4）加蒸馏水用量筒定溶至1L。 （5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。 （6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。 1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。 （7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉）,倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。 （8）稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。 （9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。 （10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。 有机营养成分 有机营养成分包括维生素、氨基酸或某些有机混合物。维生素在某些酶系统中有催化作用，加速酶功能的发挥。硫氨素（维生素 B1）可能是几乎所有植物都需要的一种维生素，缺少维生素B1时离体培养的根就不能生长或生长十分缓慢。维生素B1常常以盐酸盐的形式即盐酸硫胺素加入培养基中。盐酸吡哆醇（维生素B6）和烟酸可能有刺激生长的作用。在细胞分裂素浓度低于0.1mg/L的情况下特别需要添加维生素B1，在细胞分裂素浓度高于0.1mg/L时，烟草细胞在没有维生素B1的培养基上亦可缓慢生长，这表明细胞分裂素可能有诱导植物合成维生素B1的作用。除维生素B1、维生素B6之外，在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、维生素H（生物素）、维生素B12（氰钴胺酸）、维生素BC（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙和氯化胆碱等维生素。除叶酸外各种维生素都溶于水，叶酸需要先用少量稀氨水溶解，再加蒸馏水定容。甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（环己六醇）也是一些培养基的添加成分。另外，在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。无机营养成分 无机营养成分就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无机元素。它们在植物生活中具有非常重要的作用，如氮（ N）、硫（S）、磷（P）是蛋白质、氨基酸、核酸和许多生物催化剂即酶的主要或重要组分。它们与蛋白质、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直接的不可缺少的关系。氮占蛋白质含量的16%-18%，在植物生命活动中占有首要的地位，故又称为生命元素。磷是能量货币腺苷三磷酸（ATP）的主要成分之一，与全部生命活动紧密相连，在糖代谢、氮代谢、脂肪转变等过程中不可缺少。钾对于参与活体内各种重要反应的酶起着活化剂的作用，钾供应充分时糖类合成加强，纤维素和木质素含量提高，茎秆坚韧，植株健壮。胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸中都含有硫，这些氨基酸几乎是所有蛋白质的构成分子。镁离子（Mg 2+ ）是叶绿素分子结构的一部分，缺少镁，叶绿素就不能形成，叶子就会失绿，就不能进行光合作用。镁也是染色体的组成成分，在细胞分裂过程中起作用。钙是细胞壁的组分之一，果胶酸钙是植物细胞胞间层的主要成分，缺钙时细胞分裂受到影响，细胞壁形成受阻，严重时幼芽、幼根会溃烂坏死。现代生物学研究还证明钙是植物体内的信号分子（信使）之一，在植物信号转导中发挥重要作用，钙离子与钙调蛋白结合形成的Ca2+CaM复合体，能活化各种酶，调节植物对外界环境的反应与应答过程。 根据植物对这些元素要量的不同或者根据目前植物培养基中添加的这些元素量的大小，可将它们分成大量元素和微量元素。大量元素一般指在培养基中的浓度大于0.5mmol/L的元素，微量元素指小于0.5mmol/L的元素。1、大量元素 主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种。其中，氮常以硝态氮（NO 3- ）或氨态氮（NH 4+ ），或两者相互配合的形式存在。缺氮时某些植物的愈伤组织会出现一种很引人注目的花色素苷的颜色，愈伤组织内部不能形成导管。镁常MgSO 4 7H 2 O的形式，既提供了镁也提供了硫。硫还有用Na2SO4的形式提供，不过其中的钠（Na）对植物并不是必需的，或者说常常是不利的。磷常以NaH 2 PO 4 H 2 O,KH 2 PO 4 或（NH 4 ）H 2 PO 4 的形式提供。钾常以KCl、KNO 3 或KH 2 PO 4 形式。钙常以CaCl 2 2H 2 O、Ca（NO 3 ） 2 4H 2 O或其无水形式提供。缺硫时培养的植物组织会明显的退绿；缺磷或钾时细胞会过度生长，愈伤组织表现出极其蓬松状态。 （1）N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以硝态氮（NO 3- ）或氨态氮（NH 4+ ）两种形式供应。大多数培养基既含有硝态氮（NO 3- ）又含有氨态氮（NH 4+ ）。氨态氮（NH 4+ ）对植物生长较为有利。供应的物质有KNO 3 、NH 4 NO 3 等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。 （2）P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH 2 PO 4 或NaH 2 PO 4 等。 （3）K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1-3mg/L为好。制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类提供。 （4）Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO 4 .7H 2 O提供。用量为1-3mg/L较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl 2 .2H 2 9提供。2、微量元素 培养基的微量元素主要包括铁（Fe）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、氯（Cl）、硼（B）和钼（Mo）等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。Fe有两个重要功能，作为酶的重要组成成分和合成叶绿素所必需，缺铁时细胞分裂停止。Mn对糖酵解中的某些酶有活化作用，是三羧酸循环中某些酶和硝酸还原酶的活化剂。B能促进糖的过膜运输，影响植物的有性生殖如花器官的发育和受精作用。B还具有抑制有毒的酚类化合物的形成的作用，改善某些植物组织的培养状况，缺硼时细胞分裂停滞，愈伤表现出老化现象。Zn是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的活化剂。Cu是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影响氧化还原过程。Mo是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分。Cl在光合作用的水光解过程中起活化剂的作用，促进氧的释放和还原NADP（辅酶II）。为了某些植物组织培养的特殊需要有人还把钠（Na）、镍（Ni）、钴（Co）、碘（I）等也加入微量元素的行列。Na对某些盐生植物、C4植物和景天酸代谢植物是必需的。Ni对尿酸酶（urease）的结构和功能是必需的。但是有些成分的作用至今还不十分清楚，可人们仍然把它们加入培养基中，如碘（I）和钴（Co）等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。铁作为一种微量元素，对植物也是必需的，但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制，且常以螯合物的形式，把FeSO 4 和它的螯合剂乙二胺四乙酸钠（Na 2 EDTA）先分别配成溶液，再相互混合使形成螯合铁，以防沉淀和帮助被植物吸收。但EDTA可能对某些酶系统和培养物的形成发生有一定的作用，使用时应慎重。 为了使用方便，无论是大量元素还是微量元素都常常是先配制成母液（即比实际培养基中的使用浓度高的储存液），储存在4度冰箱内或在室温下短期存放。 总之，植物必需营养元素可组成结构物质，也可是具有生理活性的物质，如酶、辅酶以及作为酶的活化剂，参与活跃的新陈代谢。此外，在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；却锰或钼，则影响细胞的伸长。 碳水化合物 所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源，但当培养物通过光合作用提供的CO2能足以维持生长时可不在培养基上加碳源，这种情况是很少见的。用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。在改用一批新的市售白糖时最好先做预试，以防在大量使用时出现问题，伤害培养材料，造成不必要的损失，因为市售白糖是一种混合物，成分复杂且不稳定。几乎所有的培养物在蔗糖作为碳源时生长都比较好，只有少数植物或组织在葡萄糖或果糖作为碳源的培养基上生长更合适。也有用麦芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作为碳源的。蔗糖在经高温灭菌后，会发生部分降解，产生D-葡萄糖和D-果糖等，与用过滤法灭菌相比，可能会出现一些不同的实验结果，但这并不说明高温灭菌与过滤灭菌哪一种方式更好。如果要进行比较严格、精确的实验，最好用过滤法灭菌蔗糖，除此之外在大部分情况下可与培养基一起进行高温灭菌。研究表明蔗糖不仅作为碳源影响到培养物的营养状况，而且在某些情况下还会影响到细胞的分化，如在进行叶用莴苣的髓细胞培养时，诱导木质部分化的适宜浓度为2g/L，但要让木质部进一步发育则最好再提高蔗糖浓度，这样才能更有利于木质部的形成。木质部成分的分化，特别是管胞分子的分化形成，往往是器官发生的先决条件。 蔗糖、葡萄糖、白糖等的纯度问题，现在也引起人们的注意，因为在结晶时，它们往往包藏有恒量的有机物如氨基酸等，这些虽然不会使实验受到很大影响，但有时可能影响到实验结果的分析，在使用时应稍加留神。 糖的种类和用量是植物组织培养能否成功的重要因素之一。蔗糖的作用具有普遍性和广泛性，这一点已无人怀疑。近年来，其它糖类在植物组织培养中的作用引起很大关注。在淀粉作为凝固剂的培养基中加入12%蜜二糖，比只加8%蔗糖的大麦花粉培养基产生胚状体的频率高35倍，可高达40%。乳糖、麦芽糖、半乳糖和甘油均可显著促进培养的柑橘的胚状体发生。麦芽糖、麦芽浸出物和果糖对苜蓿胚状体发生的促进作用均大于蔗糖。葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖和蔗糖对培养的烟草原生质体再生都有促进作用，半乳糖则有抑制作用。麦芽糖可明显提高培养的大麦花药的绿苗产率，而蔗糖、果糖和葡萄糖单独或麦芽糖混合使用，均不利胚状体的生长。 植物生长调节剂 植物生长调节物质是一些调节植物生长发育的物质。植物生长物质可分为两类：一类是植物激素；另一类是植物生长调节剂。植物激素是指自然状态下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量（1微摩尔/升以下）有机物；植物生长调节剂是指一些具有植物激素活性的人工合成的物质。但在平常工作中人们并没有将它们严格区分开来，而笼统称之为“激素”、“植物激素”或“植物生长调节物质”。这类物质既可以刺激植物生长，也可以抑制植物的生长，对植物的生命活动真正起到调节作用。在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加赤霉素GA3等。1、生长素 生长素在植物体中的合成部位是叶原基、嫩叶和发育中的种子。成熟叶片和根尖也产生很微量的生长素。在植物组织培养中，生长素主要被用做诱导刺激细胞分裂和根的分化。在植物组织培养中常用的生长素有：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧乙酸）等。NAA有 -和-两种形式，是由人工合成的，培养基中总是用-型，所以在配制培养基时总是说加-萘乙酸。与IBA相比，NAA诱发根的能力较弱，诱发的根少而粗，但对某些植物如杨树等却具有很好的效果，IBA在根的诱导与生长上作用强烈，作用时间长，诱发的根多而长，特别有效，但也不可一概而论。IBA是天然合成的生长素，可被光迅速溶解或被酶所氧化，由于培养基中可能有氧化酶存在，所以在使用浓度上应相对较高（1-30mg/L）。对愈伤组织增殖最有效的是2，4-D，特别是对单子叶植物，10-7-10-5mol/L即可以诱导产生愈伤，常常不需再加细胞分裂素。但2，4-D是一种极有效的器官发生抑制剂，不能用于启动根和芽分化的培养基中。2、细胞分裂素 细胞分裂素是腺嘌呤（adnine,也叫6-氨基嘌呤的衍生物。腺嘌呤的第6为氨基、第2位碳原子和第9位氮原子上的氢原子可以被不同的基团所取代，当被取代时就会形成各种不同的细胞分裂素，因此，确切的讲应该叫细胞分裂素类物质。植物和微生物中都含有细胞分裂素。细胞分裂素在植物生长发育的各个时期均可表现出它的调节作用，由于它是一种腺嘌呤的衍生物，所以人们联想到它的调节作用，由于它的调节作用可能对核酸的影响有关。它可以影响某些酶的活性，可以影响植物体内的物质运输，可以调控细胞器的发生，还可以打破某些植物种子的休眠和延缓叶片的衰老。现代生物学研究初步证明，细胞分裂素可以结合到高等植物的核糖核蛋白体上，促进核糖体与mRNA的结合，加快翻译速度，从而促进蛋白质的生物合成。它还可以与细胞膜和细胞核结合，影响细胞的分裂、生长与分化。在tRNA分子的反密码子附近发现有细胞分裂素的结合位点，这可能预示着细胞分裂素在基因表达的翻译水平上具有调节作用，其实，细胞分裂素本身就是rRNA的组成部分，植物tRNA中的细胞分裂素就有异戊烯基腺苷、反式玉米素核苷、甲硫基异戊烯基腺苷和甲硫基玉米素核苷等数种。 自然情况下，细胞分裂素主要在根中合成，但根并不是唯一的合成部位，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成。 在组织培养中使用细胞分裂素的主要目的是刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。培养基中经常使用的天然的细胞分裂素主要有：从甜玉米未成熟种子或其他植物中分离到的玉米素6-（4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌呤。人工合成的细胞分裂素主要有激动素（KT，6-呋喃氨基嘌呤）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、2IP（异戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。3、赤霉素 主要是GA3，虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。虽然也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道，但在使用中仍需慎重，不可轻易添加。如果想在实验中添加赤霉素，则必须先用一些不重要的材料做预试，待获得肯定结果时再用于正式实验。4、乙烯 乙烯的作用逐渐引起重视，它在芽的诱导和管胞分化上具有一定作用，管胞分化往往又是器官发生的基础。乙烯单独地或与CO2共同加入瓶中以代替BA或BA+2，4-D的作用，促进水稻愈伤组织芽的生长，CO2对乙烯促芽的促进作用明显，AgNO3可逆转乙烯和2，4-D的抑制作用，促进小麦愈伤组织生芽。在有IAA和KT时乙烯促进Wigitalis obscura芽的形成。乙烯对芽形成的这种相对独立的效果不只是因为种的差异，也与不同发育时期植物对乙烯的敏感性不同有关。如烟草的组织随着培养时间而对乙烯的敏感性有变化，在培养早期促进芽的发端，后期则起抑制作用。温度可以影响乙烯的产生量，25-35下产生量较高，可促进水稻培养细胞产生根，15或40下产生量降低，不生根。番茄叶圆片培养时，乙烯抑制IAA诱导的生根。一般说来，依稀抑制体细胞胚胎发生，非胚性愈伤组织比胚性愈伤组织产生更多的乙烯。在悬浮培养中，乙烯对细胞的指数生长期有双向作用。由于乙烯是一种简单的不饱和碳氢化合物，在生理环境的温度和压力下，是一种气体，比空气轻，实验中很难掌握用量，所以一般不使用。高等植物各器官都能产生乙烯，但不同组织、不同器官和不同发育时期，乙烯的释放量不同。在组织培养中，培养的植物组织也会产生乙烯，如果封口用的是不透气的塑料膜，容器内就会逐渐积累乙烯，严重时可引起培养物的死亡。培养瓶内乙烯的积累量因植物种类而不同，小麦的悬浮细胞培养物24H中每克干重可产生乙烯5nmol,水稻的为6nmol，亚麻的可高达900nmol。烟草的愈伤组织产生的乙烯量比胡萝卜的高400倍。 琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外，所有的培养物都应生长在固定或半固定的培养基上以防止培养物沉入液体培养基，因缺氧而死亡。就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。它是由海藻得来的多糖类物质，但并不是培养基中的必需成分，只是作为一种凝固胶黏剂使培养基变成固体或半固体状态，以支撑培养物，虽然琼脂只是作为一种胶连物，但由于其生产方式和厂家不同而可能含有数量和种类不等的杂质，如Ca、Mg、Fe、硫酸盐等，从而可能影响到培养效果或某些实验的结果。在选择琼脂时，最好固定厂家，但国内尚没有一个比较稳固的生产厂家提供优质琼脂。虽然市售的琼脂或琼脂条价格便宜，可以使用，但其带来的潜在副作用可能是组培失败或中途夭折的主要原因。建议在经济条件允许的情况下，建议买进口、固定厂家的商品。琼脂的使用浓度取决于培养目的，使用的琼脂性能（胨力张度、灰分、热水中不溶物、粗蛋白等）等因素，一般浓度为0.4%-1%，质量越差的琼脂用量越大。除琼脂外，为了更好的调控培养物的生长，现在发展的趋势是使用一种含有琼脂的混合物作为固体胶连剂，如Sigma公司生产的Agargel就是用琼脂和Phytagl混合在一起的一种新型胶连剂，可以用来控制培养物的玻璃化。 培养基中添加琼脂使培养基呈固体或半固体状态，使培养物能够处于表面，既能吸收必需的养分、水分，又可不致因缺氧而死亡。但固体或半固体状态，一方面限制了培养基中营养成分和水的移动；另一方面也限制了培养的植物组织分泌物，特别是有毒代谢产物的扩散，使有培养物周围的营养成分逐渐匮乏，代谢产物逐渐积累，植物生长受阻或受到毒害。为了解决这个问题，人们试验使用其他支持物来代替琼脂。滤纸桥法即是一种，该法是将一张较厚的滤纸折叠成M型，放入液体培养基中，将培养的植物组织放在M的中间凹陷处，这样培养物可通过滤纸的虹吸作用不断吸收营养和水分，又可保持有足够的氧气。在此基础上，又发展出了一种类似与“看护”培养的方法，即在滤纸桥的中间凹陷处加一种固体培养基，固体培养基中也可混有分散的植物细胞团，将材料放在固体培养基上，再把滤纸放入另一种液体培养基中，用两种不同的培养基同时培养材料，可收到较好的效果。现在也有用玻璃纤维滤器或人工合成的聚酯羊毛代替琼脂的试验中人们或许能受到一些启发，即培养基中添加琼脂的目的主要是为了支持培养物，只要达到这个目的，可选用不同的材料和方法进行代替琼脂的试验。需要考虑的主要问题是，这种材料必须无毒害作用，且不被培养的植物组织所吸收，不与培养液成分发生化学反应。 琼脂作为支持物或凝固剂对绝大部分植物都是有利的或者说是无害的，但也有一些报道说琼脂对某些培养物不利。在马铃薯、胡萝卜、烟草、小麦等作物组培中，均发现以淀粉代替琼脂更有利于培养物的生长和分化。但是，目前情况下还没有哪种支持物比琼脂更优越。 其他添加剂 为了特殊的培养目的，在一部分培养基中还添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，甲硫氨酸（蛋氨酸）， L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸等氨基酸，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西红柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁，活性炭，渗透调节剂等。添加少量甲硫氨酸有促进乙烯合成和刺激木质部发生的作用，但添加多种氨基酸后往往有制止生长的作用，这可能是由于各种氨基酸之间的相互竞争而引起的。对天然提取物的应用虽然有不同观点，有的主张使用，有的主张不使用，因为其营养成分和作用无法弄明白，但在用已知化学物质无法达到目的时，适当使用一些天然混合物，的确使一些用常规培养方法没有获得愈伤或不能诱导再生的植物产生了愈伤和分化形成植株。1、活性炭 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松、孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力。粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附能力强，温度高吸附能力弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5-10g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。 茎尖初代培养，假如适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于VC和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阀值，一般为0.1%-0.25，不能