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温州大学本科毕业论文 乐清野生种群泥螺同工酶的生化遗传分析农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15 (2): 242246泥蚶能量代谢相关的同工酶的分析苏秀榕1 吕振明1 李太武1 刘志明2 钱 锟3（1.宁波大学生命科学与生物工程学院，宁波315211；2.美国东新墨西哥大学生物学系，帕特鲁斯88130；3. 美国旧金山大学生物学系，旧金山23430）摘要：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了泥蚶（Tegillarca granosa）能量代谢相关的10 种同工酶。酯酶和-淀粉酶是同能量吸收有关的酶，主要分布于消化腺里。苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、6- 磷酸葡萄糖脱氢酶和三磷酸腺苷激酶是与能量代谢相关的酶。泥蚶的能量供应有3种途径：有氧呼吸、无氧酵解和磷酸戊糖途径。从泥蚶体内含有很高活性的6-磷酸葡萄糖脱氢酶可知，磷酸戊糖途径是泥蚶糖代谢的主要途径，NADP为供能体。同其它贝类相比，泥蚶的三磷酸腺苷激酶的活性很低，这与它们的埋栖生活不活跃运动的习性是一致的。关键词：泥蚶；能量代谢；同工酶中图分类号：S185 文献标识码：A 文章编号：1006-1304（2007）02-0242-05有3类与能量代谢有关的酶，它们分别参与有氧呼吸、无氧酵解和磷酸戊糖途径。泥蚶，亦称血蚶和蚶子，属于蚶科，泥蚶属，瓣鳃类，是中国四大传统水产养殖贝类之一（Wang et al.,1993）。泥蚶含丰富的蛋白质和维生素B12，口感良好，故大规模养殖于我国沿海地区。近年来，随着水产养殖面积的增加和农业的大规模发展，在沿海区域出现了一些泥蚶疾病，造成泥蚶产量大幅度减少（Li et al., 2003）。造成这种现象的可能原因，除了海洋环境的恶化及蚶科种质资源的退化外，能量代谢的失衡也是一主要原因。因此，应持续发展农业和人工繁育技术，进一步改善海洋的生态环境和泥蚶的遗传质量，也有必要去探索海洋生物的生物能学，这将帮助我们研究这种生物的能量代谢问题。曾采用同工酶电泳技术对马来西亚半岛的6个地理种群的蜗牛进行了研究（Choh et al., 2006）。共研究了25种定居于沿海的蜗牛（软体动物门，腹足类）的4个高度多态性的同工酶位点（无机焦磷酸酶，肽酶及两个酯酶基因）（Mollusca, Gastropoda）(Zasavskaya and Pudovkin, 2005)。本文则采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对分布于各个组织的参与泥蚶生理活动及能量代谢的同工酶进行研究。本研究的最终目的就是为了探索该物种是如何进行能量吸收、能量分布和能量代谢的。1 材料与方法1.1 材料采集由浙江省海水养殖研究所提供常见的泥蚶样品，将活体运回到实验室后立即对其进行解剖并分别取出外套膜、闭壳肌、鳃、足和消化腺等5种组织，分装并保存于-70冰箱中备用。1.2 样品制备对上述5种内脏器官分别进行精确称量。用蒸馏水清洗后，放入玻璃匀浆器，按1:3比例加入0.05巯基乙醇为匀浆缓冲液，在冰浴中匀浆。于4，12000转/分离心30min。取上清液贮存于-70冰箱（Li et al., 2002）。1.3 电泳采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（Hu and wang, 1985）分析组织中的同工酶。对电泳后的胶片染色并保存于7.5醋酸。将凝胶置于凝胶电泳图像分析系统中进行分析。1.4 同工酶的命名同工酶带按从负极到正极的方向进行命名（Wang, 1996）。2 结果2.1 有关能量吸收的同工酶的表达2.1.1 酯酶见图1-A，泥蚶的酯酶（EST）同工酶结构非常复杂，其在几乎所有被测定的组织中都有很高的活性，尤其是在消化腺。这种高活性的酯酶可能与消化腺的生理功能有关。2.1.2 -淀粉酶见图1-B，泥蚶的-淀粉酶（-AMY）同工酶在消化腺中有很高的活性，但在其他组织中没有发现该酶的活性。-淀粉酶的分布是与消化腺的生理功能相一致的。2.2 同工酶表达与能量代谢2.2.1 苹果酸脱氢酶图2所示的是苹果酸脱氢酶（MDH）同工酶在泥蚶不同组织中的表达情况。总体而言，苹果酸脱氢酶的活性在5个组织中均较高，但经更仔细的观察可知，苹果酸脱氢酶在消化腺、闭壳肌和足等组织中的活性相对更高，而在其它两个组织中表现出相对较低的活性。2.2.2 苹果酸酶图3所示的是苹果酸酶（ME）同工酶在泥蚶不同组织中的表达情况。总体而言，苹果酸酶在消化腺和足部有更高的活性，同时在这两个组织中同工酶的谱带也更复杂些。2.2.3 异柠檬酸脱氢酶图4所示的是异柠檬酸脱氢酶（IDH）同工酶在泥蚶不同组织中的表达情况。异柠檬酸脱氢酶几乎在所有的组织中都有较高的活性，但在外套膜和鳃组织中的活性相对较低。2.2.4 琥珀酸脱氢酶图5所示的是琥珀酸脱氢酶（SCD）同工酶在泥蚶不同组织中的表达情况。除足部外，在其它4种组织中的酶活性大致相同。2.2.5 醇脱氢酶图6所示的是醇脱氢酶（ADH）同工酶在泥蚶各组织中的分布。总体而言，醇脱氢酶在所有组织中几乎都有较高的活性，在酶活性的强弱上并无显著差异，且不同组织中同工酶谱的表达也无显著差异。2.2.6 乳酸脱氢酶图7所示的是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶在泥蚶5个组织中表达的情况。相对而言，该酶在足和消化腺中活性最高，但与该组织中的其他同工酶相比，乳酸脱氢酶同工酶的活性是不高的。2.2.7 6-磷酸葡萄糖脱氢酶图8所示的是6磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PDH）同工酶在泥蚶5种组织中分布的情况。除足部外，该酶在其它4组织中都有相对较高的且相似的酶活性。2.2.8 三磷酸腺苷激酶图9所示的是三磷酸腺苷激酶（ATPase）同工酶在泥蚶5种组织中表达的情况。该酶的活性在足和消化腺中较高，而在其它3组织中活性相对较低。该酶的表达具较强的组织特异性。3 讨论3.1 泥蚶能量吸收的可能途径泥蚶是一种滤食性贝类，它所摄食的食物主要是硅藻。据报道，两年龄泥蚶胃和肠的食物中有97.7是硅藻。本研究证明，泥蚶含有大量的酯酶和-淀粉酶，这就为利用藻类来喂养泥蚶奠定了生理基础；同时也表明，酯类和碳水化合物可能是泥蚶能量摄入的主要渠道。现在没有明确的证据可以表明蛋白质在泥蚶的能量吸收中占有重要的地位。在本研究中也没有发现高活性的谷氨酸脱氢酶（Robainas et al., 2005），这也可能表明，蛋白质并不是泥蚶能量代谢的主要能源，同时也表明谷氨酸脱氢酶并不是蛋白质降解过程中必不可少的物质。但这两种可能性都还有待于进一步确认。3.2 泥蚶能量代谢的方式和能量利用率通过简要的分析表明，在与泥蚶能量代谢有关的同工酶中，有氧呼吸途径的酶活性是最高的，而磷酸戊糖途径中的酶活性相对较低。这表明，如同大多数动物，泥蚶的主要能源供应是来自有氧呼吸，而无氧呼吸和磷酸戊糖途径只是发挥能量代谢的辅助作用。在相同条件下，有氧呼吸可以产生更多的能量，所以它是生物进化的一个重要指标。红血球是泥蚶机体中存在有氧呼吸的重要证据。无氧呼吸是另一个重要的能量代谢途径。泥蚶是生活在海滩泥沙中的一种贝类，生态条件相当不稳定。有时候潮水能为泥蚶提供丰富的氧气。在其他时候，它是暴露在干燥的低氧条件下。在这种情况下，无氧呼吸显示出了极其重要的作用。据报道，泥蚶可以在长时间暴露在干燥的环境下，这全都要归功于这种重要的能量代谢途径。另一方面，由于泥蚶往往会把自身埋在泥土里，从而度过寒冷的冬季气候。在这种特殊时期里，无氧呼吸在其能量供应方面也起着不可或缺的作用。至于磷酸戊糖途径，从图9可知，泥蚶体内有高活性的G-6-PDH，表明可能有相当大比例的碳水化合物能以此途径代谢。该途径可为泥蚶的脂类代谢提供丰富的NADP（Oliveira et al., 2005; van Riel et al., 2005）。ATP酶是直接参与能量代谢的，所以