酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究

酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究作者摘要关键词一 实验目的1. 认识生物体中酶的存在和催化作用，便于我们了解生物体系中酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性。2. 掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析的手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。二 实验原理许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶的存在。生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是简单蛋白质，其活性取决于它的结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结合蛋白质酶，它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。其反应过程如下图所示酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH值、离子强度、温度等），25时在1min内转化1mmol底物所需要催化剂的量为活性单位。通过下式可计算酶的活性：，式中，为所用溶液的酶的活性，为最大吸收波长吸光度的变化，t为时间（min），k为多巴红的摩尔吸收系数，V为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：。式中A为原料中酶的活性（注意此处A不是吸光度A），V0为原料所得的酶溶液的总体积，m为原料总质量。三实验仪器与试剂1、仪器：分光光度计、离心机、研钵、水浴、秒表 2、试剂：二羟基苯丙胺酸（多巴）、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、土豆四实验步骤1.溶液配制0.10mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.2）：50ml 0.20mol/L磷酸二氢钠+8ml 0.1mol/L盐酸，定容至200ml；0.10mol/L磷酸缓冲溶液（pH=6.0）：50ml 0.20mol/L磷酸二氢钠+22ml 0.1mol/L盐酸，定容至200ml；0.10mol/L多巴溶液：0.195g多巴，用pH=6.0的磷酸缓冲溶液定容至100ml（现用现配）。2酶的提取取新鲜土豆，清洁后切碎，称取10.0g置于研钵中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压，两层纱布滤出提取液，立即离心分离（3000rpm，5min），倾出上层清液保存于冰浴中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。3. 酶的活性测量取2.5ml上述提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释到10ml比色管中，摇匀分别取0.1mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入2.5mL pH=6.0的缓冲溶液，再加入2ml多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在480nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。取0.2ml，0.3ml。0.4ml已稀释过提取液重复上述实验（总体积为5ml）。以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。五实验数据记录及讨论数据记录12345681012140.1340.1360.1410.140.1430.1470.1520.1570.160.1650.1870.1980.2140.2210.2350.2370.2470.2490.2480.2490.2070.2170.2290.2360.2440.2570.2710.2860.2920.2870.2930.2970.3050.3170.3260.3340.340.3460.3520.365表格 1 吸光度随时间变化的记录图表 1 吸光度随时间变化已稀释提取液的体积/ml活性/Amin-1原提取液活性（ml-1）原料活性/g-10.104.7919.150.2010.4741.900.306.4525.800.404.3417.36影响酶活性的因素的研究（1） 取0.40ml稀释过了的提取液在沸水浴中加热5min，冷却后配成测定溶液，观察现象。（2） 取0.40ml稀释过的提取液，加入少量的固体Na2S2O3配成测定溶液，观察现象。（3） 取0.40ml稀释过的提取液，加少量EDTA振动混合，反应一段时间后配成测定溶液，观察现象。时间123456煮沸117118120118118117EDTA103105107108111113Na2S2O3777677787776表格 2六实验结果讨论1、影响酶活性的因素有哪些？答：酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。 2、提取物在放置过程中为何会变黑？ 答：它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生反应，生成黑色素。3、热处理后酶的活