GB15193.7-1994小鼠精子畸形试验.pdf

中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G li 1 5 1 9 3 . 7 一 9 4 小 鼠 精 子 畸 形 试 验 S p e r m s h a p e a b n o r ma l i t y t e s t i n mi c e 1 主题内容与适用范围 本标准规定了小鼠 精子畸形试验的基本技术要求。 本标准适用于检测环境有害物质对雄性生殖细胞的遗传毒性。 2 原理 小鼠精子畸形受基因控制， 具有高度遗传性， 许多常染色体及X , Y性染色体基因直接或间接地决 定精子形态。 精子的畸形主要是指形态的异常， 已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结 果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。 小鼠 精子畸形试验可 枪测环境因子对 精子 生成、 发育的影响， 而且对已知的生殖细胞致突变物有高度敏感性， 故本试验可用作检测环境因子在体 内对生殖细胞的致突变作用。 3 仪器及试荆 全部试剂除注明外， 均为分析纯， 试验用水为蒸馏水。 3 . 1 实验室常用设备。 3 、 2 生物显微镜。 3 . 3 甲醇 3 . 4 1 /-2 %伊红染色液: 称取伊红1 - v 2 g , 溶于1 0 0 m L蒸馏水备用。 4 实验步骤 4 门动物 6 -8 周龄( 体重2 5 -3 5 g ) 4 . 2 剂量分组 设一个阴性对照( 溶剂) 组， 一个阳性对照组及三个试验组， 每组至少有5 只存活动物。阳性物可采 用环磷酸胺4 0 6 0 m g / ( k g d ) 或甲 基磺酸甲酷( MM S ) 5 0 m g / ( k g d ) ， 丝裂霉素C ( MM C ) I。 一 1 . 5 m g / ( k g “ d ) 4 最高剂量可取最大耐受量， 或分别取1 / 2 , 1 / 4 和1 / 8 I , D s o 作为剂量组。 经口 给予， 连 续 5 d 4 . 3 操作步N 4 . 3 . 1 动物处死时间: 各种致突变物作用于精子的不同发育阶段， 可在接触某种致突变物后不同时间 出现精子畸形， 故有条件时， 可给于受试物后第一、 四、 十周处死动物， 检查精子形态 因为大部分化学致 突变物对精原细胞后期或初级精母细胞早期的生殖细胞较为敏感， 故一般均是于首次给受试物后的第 3 5 d 处死。 4 . 3 . 2 用颈椎脱臼法处死小鼠， 取出二侧副擎 放入盛有适量生理盐水( 1 m l - ) 的小烧杯中或放入盛有 中华人民共和国卫生部1 9 9 4 一 0 8 一 1 0 批准1 9 9 4 一 0 8 一 1 0 实施 G s 1 5 1 9 3 . 7 -9 4 2 m L 生理盐水的平皿中。 用眼科剪将副肇纵向剪1 -2 刀， 静止3 -5 m i n , 轻轻摇动。 用四层擦镜纸或 合成纤维血网袋过滤， 吸滤液涂片。 空气干 燥后， 用甲 醇固定5 m i n 以上干燥 用1 写-2 写 伊红染色1 h , 用水轻冲， 干燥。 4 . 3 . 3 镜检: 在低倍镜下( 用绿色滤光片) 找到背景清晰精子重叠较少的部位、 用高倍镜顺序检查精子 形态， 计数结构完整精子。 精子有头无尾( 轮廓不清) 或头部与其他精子或碎片重叠， 或明显是人为剪碎 者， 均不计算， 每只动物至少检查1 0 0 0 个精子。 精子畸形， 主 要表现在头部， 其次为尾部， 畸形类型可分为无钩、 香蕉形、 胖头、 无定形、 尾析叠、 双 头、 双尾等。 异常精子均应记录显微镜的坐标数， 以备查询。 并分别记录异常类型， 以便统计精子畸形率 及精子畸形类型的构成比。 判断双头、 双尾畸形时， 要注意与二条精子的部分重叠相鉴别， 判断无定形时要与人为剪碎及折叠 相鉴别。 5 统计方法及结果判定 每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行参数统计方法比 较， 如用W i l c o s o n 秩和检验法评价精 子畸形阳 性的标准是， 畸 形率至少为阴 性对照组的倍量或经统计有显著意义， 并有剂量反应关系。 一般阴 性对服组的精子异常率为0 . 8 %-3 . 4 0/ n ， 供参考。 但应有本实验室所用实验动物的自 发畸 形率作参考。 附加说明: 本标准由中华人民共和国 卫生部卫生监督司