GB15193.6-2003哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验.pdf

I C S 0 7 . 1 0 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB 1 5 1 9 3 . 6 - 2 0 0 3代替 G B 1 5 1 9 3 . 6 -1 9 9 4A 甫 乳动物骨髓细胞染色体畸变试验Ma mma l i a n b o n e ma r r o w c e l l c h r o mo s o mea b e r r a t i o n t e s t2 0 0 3 - 0 9 - 2 4发布2 0 0 4 - 0 5 - 0 1 实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB 1 51 9 3 . 6 - 2 0 0 3前言 本标准全文强制 本标准代替G B 1 5 1 9 3 . 6 - 1 9 9 4 骨髓细胞染色体畸变试验 本标准与G B 1 5 1 9 3 . 6 -1 9 9 4 相比的主要修改如下: 将标准名称“ 骨髓细胞染色体畸变试验” 改为“ 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验” ; 在“ 范围” 中 增加了受试物的 具体内 容: 食品生产、 加工、 保藏、 运输和销售过程中 所涉及的可能 对健康造成危害的化学、 生物和物理因素， 检验对象包括食品添加剂( 含营养强化剂) 、 食品新 资源及其成分、 新资源食品、 辐照食品、 食品容器与包装材料、 食品工具、 设备、 洗涤剂、 消毒剂、 农药残留、 兽药残留、 食品工业用微生物等; 增加不适用范围; 将原操作步骤中“ 5 . 1 动物处理” 标题下的有关内容分列为 “ 试验动物” 、 “ 剂量及分组” 和“ 操 作 步 骤” 三 章; 增加章题“ 试验动物” ， 将“ 取健康成年大、 小鼠” 改为“ 常用健康年轻的成年大鼠或小鼠” ; 增加章题“ 剂量及分组” ， 并将高剂量组的设计方法增加一条“ 急性毒性试验给予受试物最大剂 量( 最大使用浓度和最大灌胃 容量) 求不出L D s 。 时 高剂量组则按以下顺序 a ) 1 0 g / k g 体 重; b ) 人的可能摄人量的 1 0 。倍; 或 c一次最大灌胃刘量进行设计” ; 增加参考阳性对照 物“ 丝裂霉素C O. 5 m g / k g 体重2 . 0 m g / k g 体重) ， 或环磷酞胺( 4 0 m g / k g 体重) ” ; 将原 5 . 1 . 2 ” 剂量设计以外的内容放在增加的“ 操作步骤” 标题下， 并在此标题下增加“ 受试物 配制” 的有关内容; 增加“ 结果判定” 内容 自本标准实施之日起， GB 1 5 1 9 3 . 6 -1 9 9 4同时废止。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、 哈尔滨医科大学、 杭州市卫生防疫站。 本标准主要起草人: 韩驰、 唐玲光、 袁振华。 本标准于1 9 9 4 年首次发布， 本次为第一次修订。GB 1 5 1 9 3 . 6 - 2 0 0 3哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验范围 本标准规定了哺乳动物骨1im染色体畸变试验的基本技术要求 本标准适用于评价食品生产、 加工、 保藏、 运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素对大、 小鼠 骨髓细胞的遗传毒性， 检验对象包括食品添加剂( 含营养强化剂) 、 食品新资源及其成分、 新资源食品、 辐照食品、 食品容器与 包装材料、 食品工具、 设备、 洗涤剂、 消毒剂、 农药残留、兽药残留、 食品工业用微生物等 本标准不适用于有证据表明受试物或反应代谢产物达不到靶组织( t a r g e t t i s s u e ) -骨髓的情况，2 原理 染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体， 当化学物质作用于细胞周期G 1 期和s 期时，诱发染色体型畸变， 而作用于G 2 期时则诱发染色体单体型畸变。 给试验的大、 小鼠腹腔注人秋水仙素， 抑制细胞分裂时纺锤体的形成， 以便增加中期分裂相细胞的比例， 并使染色体丝缩知、 分散， 轮廓清晰. 在显微镜下观察染色体数口 和形态3 仪器与试剂 全部试剂除注明外均为分析纯， 试验用水为燕馏水3 . 1 0 . 1 % 秋水仙素: 笠于 棕色瓶中， 冰箱保存3 . 2 2 . 2 % 柠檬酸钠3 . 3 p H 7 . 4 磷酸盐缓冲液3 . 3 . 1 1 / 1 5 m o l / L 磷酸氢二钠溶液 磷酸氢二钠( N a e H P O , A 4 7 g 溶于1 0 0 0 m L 蒸馏水中3 . 3 . 2 1 / 1 5 m o l / L 磷酸二氢钾溶液: 磷酸二氢钾( K H ., P O ,) 4 9 . 0 7 g 溶于1 0 0 0 m 1- 燕馏水中3 . 3 . 3 将磷酸氢二钠溶液8 0 m l 与磷酸二氢钾溶液2 0 m L 混合， 用p H计测定并调节p F I 至7 . 43 . 4 0 . 0 7 5 m o l / L氯化钾溶液。3 . 5 甲醇( 分析纯) : 冰乙酸( 分析纯) 以3 ， 1 混合， 临用时现配3 . 6 G i e m s a溶液3 . 6 . 1 G i e m s a 储备液: 取G i e m s a 染料3 . 8 g , 置玛瑙乳钵中， 加少量甲 醇研磨， 逐渐加甲醇至3 7 5 m L溶解后再加1 2 5 m L 纯甘油， 于3 7 0C 温箱保温4 8 h在此期间摇动数次 放置1 周- 2 周过滤备用3 . 6 . 2 G i e m s a 应用液: 取1 m 工 储备液加入1 0 , L p H 7 . 4 磷酸缓冲液3 7 4 V 器与设各 寒盼室常用设备、 恒温水洛锅( 3 7 士5 0C) , 离心机、 生物显微镜，4 实验动物常用健康年轻的成年大鼠 或小鼠。 每组用两种性别的动物至少各5 只。动物购买后适应环境至少3天5 荆量及分组 受试物应设三个剂量组， 最高剂量组原则上 为动物出现严重中毒表现和/ 或个别动物出现死亡的剂量， 一般可取工 / 2 L D , ， 低剂量组应不表现出毒性， 分别取1 / 4 和1 / 8 L D。 作为中、 低剂量 急性毒性试验给予受试物最大剂量( 最大使用浓度和最大灌胃 容量) 动物无死亡而求不出L D 。 时， 高剂量组则按以 51GB 1 51 9 3 . 6 - 2 0 0 3下顺序 : a )中、 低剂量组1 0 g / k g 体重; b ) 人的可能摄人量的1 0 。 倍; 或c ) 一次最大灌胃剂量进行设计， 再下设。 另设溶剂对照组和阳性对照组， 阳性物可用丝裂霉素C ( 1 . 5 m g / k g 体重2 . 0 m g / k g体重) 或环磷酞胺( 4 0 m g / k g 体重) 经口或腹腔注射( 首选经口) 给予。6操作步骤6 . 1 受试物配制 一般用蒸馏水作溶剂， 如受试物不溶于水， 可用食用油、 医用淀粉、 狡甲基纤维素配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制， 除非有资料表明以溶液( 或悬浊液、 乳浊液等) 保存具有稳定性。6 . 2 实验动物的处理 经口给予受试物2 次4 次， 每次间隔2 4 h ， 在末次给受试物后1 8 h -2 4 卜 取材。必要时可先用一个剂量的3 只动物， 于给受试物后 6 , 2 4 , 4 8 h分别处死动物取材， 以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用 1 5 只动物， 于6 , 2 4 , 4 8 h 后分别各处死5只动物取材。处死动物前 2h4 h ， 按4 m g / k g 体重腹腔注人秋水仙素。 大鼠断头处死， 小鼠 颈椎脱臼。6 . 3 标本制备6 . 3 . 1 取材 取股骨， 去附着的肌肉， 剪去两端骨髓， 用带针头的注射器吸取 2 m L -4 mL 2 . 2 %柠檬酸钠溶液，将骨髓洗人 1 0 m L离心管中， 反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色， 然后以 1 0 0 0 r / m i n -1 5 0 0 r / m i n 离心 1 0 m i n ， 弃去上清液。6 . 3 . 2 制片 离心后的沉淀物加人4 mL O . 0 7 5 mo l / L氯化钾溶液， 混匀后在3 7 水浴或恒温箱中放置1 0 mi n -2 0 m i n ， 再以1 0 0 0 r / mi n -1 5 0 0 r / m i n 离心， 弃去上清液。 将新配制的甲醇一 冰乙酸固定液4 m L沿管壁加人受试物中， 1 0 m i n -1 5 mi n后， 用吸管将细胞团块打碎继续固定 1 0 m i n -1 5 mi n ， 以 1 0 0 0 r / mi n离心 1 0 m i n弃去上清液， 再加固定液 4 m L静置2 0 mi n 后离心， 弃去上清液， 用吸管混匀制成 。 . 5 m1 _ -1 . 0 ml细胞悬液。 先将洗净的载玻片保存于冰水中备用。自冰水中取出载玻片， 倾斜 3 0 放置， 立即吸取细胞悬液在玻片的1 / 3 处滴 3 滴， 轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个标本制 2张一3张玻片， 空气中自然干燥 临用时取G i e m s a 储备液1 m L , 磷酸盐缓冲液1 0 m L ， 置染色缸中， 将涂片浸于染液中染色 1 5 m i n左右， 取出玻片用水冲洗， 空气中自然干燥。6 . 4 阅片6 . 4 . 1 阅片要求 在低倍镜下检查制片质量， 制片应为全部染色体较集中， 而各个染色体分散、 互不重叠、 长短收缩适中、 两条单体分开、 清楚地显示出着丝点位置、 染色体呈红紫色。用油镜进行细胞中期染色体分析。每只动物分析 1 0 。 个中期相细胞， 每个剂量组不少于 1 0 0 0 个中期相细胞。6 . 4 . 2 观察项 目6 . 4 . 2 . 1 染色体数目的改变6 . 4 . 2 . 1 . 1 非整倍体: 亚二倍体或超二倍体6 . 4 . 2 . 1 . 2 多倍体: 染色体成倍增加6 . 4 . 2 . 1 . 3 内复制: 包膜内的特殊形式的多倍化现象6 . 4 . 2 . 2 染色体结构的改变6 . 4 . 2 . 2 . 1 断裂: 损伤长度大于染色体的宽度。6 . 4 . 2 . 2 . 2 微小体: 较断片小而呈圆形6 . 4 . 2 . 2 . 3 有着丝点环: 带有着丝点部分， 两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。 5zGB 1 51 9 3 . 6 - 2 0 0 36 . 4 . 2 . 2 . 46 . 4 . 2 . 2 . 56 . 4 . 2 . 2 . 66 . 4 . 2 . 2 . 76 _ 4