GB4789.30-1994食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验.pdf

中华 人民共和 国国家标准 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 Mi c r o b i o l o g i c a l e x a mi n a t i o n o f f o o d h y g i e n e E x a mi n a t i o n o f L i s t e ri a m o a o c y t o g e n e s G B 4 7 8 9 . 3 0 -9 4 1 主肠内容与适用范围 本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。 本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。 2 引用标准 G B 4 7 8 9 . 2 8 食品 卫生微生物学检验 染色法、 培养基和试剂 3 设备和材料 3 . 1 温箱 3 0和 2 5。 3 . 2 天平。 3 . 3 5 0 0 m L三角瓶。 3 . 4 接种环。 3 . 5 接种针。 3 . 6 载玻片。 3 . 7 盖玻片。 3 . 8 显微镜或相差显微镜。 3 . ， 平皿。 3 . 1 0 试管。 3 . 1 1 均质器。 3 . 1 2 无菌注射器。 3 . 1 3 吸管: 1 m L , 1 0 m L . 3 . 1 4 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。 3 . 1 5 马红球菌。 4 培养垂和试荆 含。 . 6 %酵母浸膏的胰酪大豆肉汤( T S B - Y E ) 含 。 . 6 0 0 酵母浸膏的胰酪大豆琼脂( T S A - Y E ) E B增菌液: 见附录 A3 , L B增菌液( L B , , L B , ) : 见附录 A4 , 三糖铁( T S I ) 琼脂 , G B 4 7 8 9 . 2 8中 4 . 2 6 , 4 . 2 7 : 见附录A 1 : 见附录A 2 妇424.34.445 中华人民共和国卫生部 1 9 9 4 一 0 3 - 1 8 批准1 9 9 4 一 0 9 一 0 1 实施 G B 4 7 8 9 . 3 0 -9 4 4 . 6 S I M 动力培养基: 见附录A5 . 4 . 7 血琼脂: G B 4 7 8 9 . 2 8 中4 . 6 . 4 . 8 改0的Mc B r i d e ( MMA) 35 脂: 见附录A5 , 4 . 9 硝酸盐培养基: G B 4 7 8 9 . 2 8 中3 . 1 7 . 4 . 1 0 缓冲葡萄 糖蛋白 陈水( M R和V P 试验用) : G B 4 7 8 9 . 2 8 中3 . 4 . 4 . 1 1 糖发酵培养基: G B 4 7 8 9 . 2 8 中3 . 2 . 4 . 1 2 过氧化氢酶试验: G B 4 7 8 9 . 2 8 中4 . 3 8 , 4 . 1 3 盐酸a y 咤黄( A c r i f l a v i n e H C l ) ( S i g m a ) . 4 . 1 4 蔡q酮酸钠盐( N a l a d i x i c a c i d ) ( S i g m a ) . 5 检验程序 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下 : 增菌 分离培养 纯培养 确证试验 3 2 7 G B 4 7 8 9 . 3 0 -9 4 6 操作步骤 6 . 1 样品的收集及处理 无菌采取样品2 5 g ( m L ) 放灭菌均质器中加2 2 5 m L E B 和L B增菌液中， 充分搅拌成均质。 如不能 及时检验， 可暂存4冰箱。 62 增菌培养 E B增菌液放3 0 士1 培养4 8 h -7 d , L B ， 增菌液2 2 5 m L放3 0 士1 0C， 培养2 4 h ， 取出0 . 1 m l ， 加 入1 0 m L L B : 增菌液中二次增菌。 6 . 3 分离培养 将E B增菌液和L B : 二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上， 培养3 0 土1 4 8 h ， 挑选可 疑菌落， 用白炽灯4 5 。 角斜光照射平板， 李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色， 小的圆形的菌落。 6 . 4 选5 个以上的上述可疑菌落接种三糖铁( T S I ) 琼脂和S I M动力培养基， 培养于2 5 士1 ， 观察是 否有动力， 且成伞状或月芽状生长。一般观察2 -7 d ， 阳性者可做下一步鉴定。 6 . 5 纯培养 将上述有动力、 形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上层、 下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种 于胰酪陈大豆琼脂培养基( T S A - Y E ) 上， 做纯培养供做以下鉴定。 6 . 6 染色镜检 将上述可疑纯培养物做革兰氏 染色并做湿片检查; 李斯特氏 菌为革兰氏阳 性小杆菌， 大小为。4 - 0 . 5 W m X O . 5 -2 . 0 P m ; 用生理盐水制成菌悬液， 在油镜或相差显微镜下观察， 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。 6 . 了 生化特性 将上述可疑菌做进一步的生化试验， 单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有关菌的区别见 表 1 . 表 1 单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别 菌种溶血反应 硝酸盐还原尿素酶MR - V P甘露醉鼠 李糖木糖七叶昔 单核细胞增生李斯特氏菌 ( L . m a n o c y t o g e n e s ) +/ + 绵羊李斯特氏菌 ( L . i v a n o v i i ) +/ + 英诺克李斯特氏菌 ( L. i n n o . . .) 十/ + 威尔斯李斯特氏菌 ( L. me l s h i me r i ) 十 / + 西尔李斯特氏菌 ( L. me l i g e r i ) +/ + 格氏李斯特氏菌 ( L. g r a y i ) +/ + 默氏李斯特氏菌 + / + ( L . mu r r a y i ) 注: V反应不定; +阳性; 一阴性。 G B 4 7 8 9 . 3 0 -9 4 6 . 8 对小鼠的致病力试验 将符合上述特性的纯培养物接种于T S B - Y E中， 在3 0培养2 4 h ， 离心， 浓缩， 使浓缩液每毫升 1 0 0 / m L个细菌， 取0 . 5 m L浓缩菌液注射小白鼠腹腔， 3 -5 只， 观察小鼠死亡情况。 致病株于2 -5 d内 死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、 绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。 6 . 9 协同溶血试验( c A MP ) 在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌 ( R . e q u i ) ， 在它们中间垂直接种可疑李斯特氏 菌， 但不要触及它们. 在3 0培养2 4 4 8 h , 检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。 靠近金黄色葡萄 球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强， 西尔李斯特氏菌的溶血也增强， 而绵羊李斯特氏菌在 马红球菌附近的溶血增强， 有助于鉴别。 G B 4 7 9 9 . 3 0 -9 4 ， 一 钾 ， ， ， 勺 ， 一 一 卜 ， 墓 A 录养 附 培 ( 补充件) A 1 含0 . 6 % 醉母浸膏的胰酪膝大豆肉汤( T S B - Y E ) A 1 . ， 成分 胰陈1 7 9 多价陈3 9 酵母膏6 9 氯化钠5 9 磷酸氢二钾2 . 5 9 葡萄糖2 . 5 9 蒸馏水1 0 0 0 mL A 1 . 2 制法 将上述各成分加热搅拌溶解， 调至p H 7 . 2 -7 . 4 ， 分装, 1 2 1 灭菌1 5 m i n ， 备用。 A 2 含0 . 6 醉母奋胰酪膝大豆琼脂( T S A - Y E ) A 2 门成分 胰陈1 7 g 多价陈3 9 酵母膏 6 9 氯化钠5 g 磷酸氢二钾2 . 5 9 葡萄糖2 . 5 9 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 m L A 2 . 2 制法 将上述各成分加热搅拌溶解， 调p H至7 . 2 -7 . 4 ， 分装, 1 2 1高压灭菌， 备用。 A 3 E B增菌液 A 3 . ， 成分 胰陈1 7 g 多价陈3 9 酵母膏6 9 G B 4 7 8 9 . 3 0 -9 4 氯化钠5 9 磷酸氢二钾2 . 5 9 葡萄搪2 . 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m L 盐酸叮吮黄1 5 m g / L 蔡咤酮酸4 0 m g / L A 3 . 2 制法 除叮吮黄和蔡吮酮酸外， 其余成分加热混合调p H至7 . 2 7 . 4 , 1 2 1 0C 1 5 m i n 高压灭菌。 使用前加 叮吮黄溶液1 5 m g / L和蔡咤酮酸溶液4 0 m g / L ， 此两种成分要无菌配制或过滤除菌。 A 4 李氏增菌肉汤( L B , , L B 2 ) A 4 . 1 成分 胰膝5 9 多价陈5 9 酵母膏5 9 氯化钠5 9 磷酸二氢钾1 . 3 5 g 磷酸氢二钠1 2 g 七叶昔1 9 蒸馏水1 0 0 0 m L A 4 . 2 制法 将上述成分加热溶解， 调p H至7 . 2 -7 . 4 ， 分装, 1 2 1 1 5 m i n 高压灭菌。 A 4 . 2 . 1 李氏 I 液( L B , ) 2 2 5 m L中加入: 1 %禁吮酮酸( 用。 . 0 5 m o l / L氢氧化钠溶液配制) 。 . 4 5 m L 1 %叮咤黄( 用灭菌蒸馏水配制)0 . 2 7 m L A 4 . 2 . 2 李氏D 液( L B i ) 2 0 0 m L中加入: 1 % 蔡吮 酮酸 夕 . 4 0 m L 1 %叮吮黄。 . 5 0 mL 无菌分装于1 0 m L大试管中。 A 5 改良的Mc B r i d e 琼脂( MMA ) A 5 . 1 成分 胰陈5 9 多价陈5 9 牛肉膏3 g 葡萄糖1 9 G B 4 7 8 9 . 3 0 -9 4 氯化钠5 9 磷酸氢二钠1 g 苯乙醇2 . 5 m L 无水甘氨酸1 0 g 氯化铿0 . 5 g 琼脂1 5 g 燕馏水1 0 0 0 m L A 5 . 2 制法 将上述成分加热搅拌混匀， 调p H至7 . 2 -7 . 4 ， 分装, 1 2 1 1 5 m i n 高压灭菌， 备用。 A 6 S I M动力培养墓 A 6 . 1 成分 胰脉2 0 g 多价陈6 9 硫酸铁钱0 . 2 9 硫代硫酸钠0 . 2 9 琼脂3 . 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m L A 6 . 2