HLADRB1基因对小儿急性肾小球肾炎的影响.doc

HLA-DRB 1 基因对小儿急性肾小球肾炎的影响 作者：焦立新 孙利炜 刘宇奇 【关键词】 急性肾小球肾炎,HLA-DRB,1,基因,ssp/PCR【摘要】 目的 探讨急性肾小球肾炎发生及发展与HLA-DRB 1 等位基因的关系，寻找该病的HLA-DRB 1 易感基因。方法 采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法对急性肾小球肾炎患儿和正常儿童的HLA-DRB 1 等位基因进行分析，并分析了HLA-DRB 1 15基因型在急性肾小球肾炎中所起的作用。结果 急性肾小球肾炎患儿HLA-DRB 1 15基因频率为（16.25%），与正常对照组比较差异有非常显著性（P<0.01）;HLA-DRB 1 15型急性肾小球肾炎患儿临床症状表现重。结论 HLA-DRB 1 基因型对急性肾小球肾炎的发生、发展有一定的影响;探讨急性肾小球肾炎的HLA-DRB 1 基因型对于病情预测有重要意义。关键词 急性肾小球肾炎 HLA-DRB 1 基因 ssp/PCR The influence of HLA gene on acute glomerulonephritis【Abstract】 Objective To study the relation between acute glomerulonephritis occurence and development and HLA gene，then to find HLA predisposing gene of this disease.Methods Using ssp-PCR method to study acute glomerulonephritis patients HLA gene and assay different clinical situations of different HLA gene types.Results The gene frequency of acute glomerulonephritis patients is16.25%.It is significantly higher than normal control group（P<0.01）;Acute glomerulonephritis patients who was HLA-DRB 1 15were more severe.Conclusion The occurrence and the development of children acute glomerulonephritis have some relations with HLA-DRB 1 15.It is important to study HLA gene of children acute glomerulonephritis for judging prognosis. Key words acute glomerulonephritis HLA gene ssp/PCR 目前公认免疫机制是大多数肾小球疾病发病机制的主要环节。其直接证据如:病变肾脏沉着有免疫球蛋白和补体成分，同时肾小球疾病病程中血清有免疫成分的异常。肾小球疾病的免疫发病机制十分复杂，有多种因素参与。对于免疫发病机制的研究不仅有其理论意义，还可以指导疾病的防治，具有重要的临床意义。HLA即人类白细胞抗原也称人组织相容性抗原系统，是参与机体特异性免疫识别和免疫应答的主要成分 1 。我们对86例急性肾小球肾炎患者和82例健康儿童的HLA-DRB 1 基因进行了分型研究，以期发现免疫机制在急性肾小球肾炎的发病机制中所起的作用，现报告如下。1 对象与方法 1.1 对象 观察组为86例急性肾小球肾炎患儿，男42例，女44例，年龄316岁，诊断标准参照诸福棠第七版实用儿科学有关章节。对照组82例，男43例，女39例，年龄416岁，排除肾脏疾病，体格检查及化验均未见异常。观察组与对照组均为无血缘关系的汉族儿童。1.2 方法 1.2.1 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs均为上海复生生物工程公司产品，琼脂糖为上海东海制药厂产品。DNA片段长度标准174/HacMarkers为北京鼎国生物工程公司产品。 1.2.2 扩增引物设计与合成 引物按参考文献 2 所示，见表1，由北京赛百盛生物工程公司合成。 1.2.3 内对照引物 参照参考文献 2 在DRB1第3内含子内设计，由赛百盛生物工程公司合成，这个引物无位点序列特异性，可以作为内对照，序列如下:5-TGC CAA GTG GAG CAC CCA AA，3-GCA TCT TGC TCT GTG CAG AT;产生796bp的产物。 1.2.4 阳性细胞DNA 由北京医科大学人民医院基因配型室馈赠。 1.2.5 人基因组DNA提取 抽取静脉血1.0ml，2%EDTA抗凝。分离白细胞采用常规酚-氯仿方法提取DNA，然后用紫外分光光度计测其浓度。 1.2.6 DRB 1 位点的特异性PCR抗增 通过SSP/PCR进行，一个标本需完成19个PCR反应，方能完成DRB 1 位点的分型。反应混合物包括24个位点或组特异PCR引物，内对照引物浓度很低，约为特异引物浓度的1/3，MgCl 2 10mm Trist-Cl、pH8.3，0.001%明胶，200mm dNTPs，1m位点组特异引物，0.3m内对照引物，2UTaq酶。PCR扩增在TC-1（美国PE公司）扩增仪上完成，循环条件:先94预变性5min，然后每个循环包括941min，571min，721min，共35个循环，然后72保温5min。 1.2.7 通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析 PCR产物的存在及缺失通过2%琼脂糖凝胶电泳进行，加2l的6x上样缓冲液，10l PCR产物，电压40V，电泳40min，溴化乙啶（0.5g/ml）染色。在紫外分光光度计下观察结果，拍照。1.2.8 统计学方法 用SAS软件包进行处理。表1 引物序列、长度及区分位点略2 结果 2.1 分型结果 DR位点基因共分19个型，其中3与17、18，18与14有交叉，52、53可作为阳性对照，因52可与11、12、13、13、14、14、17、18同时出现阳性带，53可与4、7、9同时出现阳性带，分型结果见图1、2。 图1 略图2 略 2.2 肾小球疾病患儿DRB 1 基因型及基因频率 86例肾小球疾病患者与82例正常人HLA-DRB 1 19个位点基因型及基因频率见表2，肾小球疾病组HLA-DRB 1 15基因频率为16.25，与正常对照组（基因频率4.7）比较 2 =7.028，P<0.01，HLA-DRB 1 15基因阳性发生急性肾小球肾炎的相对危险性OR为3.494，其他位点两组间差异无显著性，见表2。表2 HLA-DRB 1 基因频率基因型 正常对照组略2.3 肾小球肾炎患儿临床表现 86例急性肾小球肾炎有11例HLA-DRB 1 15型，其临床表现浮肿、血尿较非HLA-DRB 1 15型重，基因型与临床症状的关系见表3。 3 讨论HLA已经被证实与自身免疫疾病相关联，是参与机体特异性免疫识别和免疫应答的主要成份，已知HLA是机体的正常生理识别和免疫应答的主要成分。所以HLA与机体正常的生理功能和病理变化有密切关系，是参与机体特异性免疫识别和免疫应答的主要成分，参与免疫调节，约束免疫细胞间的相互作用;参与抗原的处理;参与免疫细胞分化;疾病易感基因学说认为在HLA区域中尤其是HLA-D区域附近可能存在一些疾病易感基因，这些基因的存在可导致某些疾病，但具体是一位点与一种疾病相关，还是多个位点与一种疾病相关，还不能肯定。 我们这一研究旨在探讨小儿急性肾小球肾炎与HLA的相关性。因为经典的HLA-类基因指的是HLA-DR、-DQ、-DP，其中以DR基因位点最多，且迄今所建立的HLA的DNA分型技术也以对HLA-DRB 1 多态性的分析最为成熟，故我们将研究重点放在HLA-DRB 1 上。表3 急性肾小球肾炎组HLA-DRB 1 15型与临床表现的关系 （略）对于肾小球疾病，我国儿科应用的分类包括肾小球肾炎、肾病综合征、单纯性血尿或蛋白尿、家族性肾炎等。我们主要研究了急性肾小球肾炎86例。国内尚未见有关报道汉族人群小儿肾小球疾病与HLA-DR位点关联的报道。本文对86例急性肾小球肾炎患儿和82例正常人HLA-DR位点基因的多态性进行调查，结果表明急性肾小球肾炎组HLA-DRB 1 15基因频率增高，（ 2 =7.028，P<0.05），86例肾小球肾炎有11例HLA-DRB 1 15型，其临床表现浮肿、血尿较非HLA-DRB 1 15型重，上述结果证实，吉林省汉族小儿肾小球疾病的发生与HLA-DRB 1 15关联。 关于肾小球疾病与HLA关系，最初有人报道小儿原发性肾病综合征与一些HLA-B抗原存在弱相关;1976年国外学者Thomson、1980年Alfiler、1990年Clara分别报道肾病综合征患儿HLA-B12、HLA-DR7较正常对照高。1999年国内肖露露研究认为成人慢性肾小球肾炎与HLA系统免疫机制强相关 3 ，HLA-B 55 、DR 10 、DQ 7 可能是广东人群易感慢性肾小球肾炎的风险因子。1999年许铃娣等实验结果DQB 1 0302等位基因可能与上海汉族IgA肾病的发病有一定关联 4 。我们的研究有所不同，HLA-DRB 1 15可能 是吉林省小儿人群肾小球疾病的易感基因，其原因可能在于我们研究的人群和病种有所不同。通过对患者与正常人的HLA-DR位点的多态性分析，我们对小儿肾小球疾病有了进一步的认识，各个基因型之间的碱基差异虽然不是很大，但可以导致表达的氨基酸不同，最终引起免疫应答的差异等一系列的变化;随着对疾病认识的深入，将为我们治疗疾病提供科学依据。 参考文献 1 曹孟德，秦东春，孙含笑.HLA分子生物学及临床应用.郑州:河南医科大学出版社，1998，148. 2 Olle Olerup，henrik Zetterquist.HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers（PCR-SSP）in2hours:An alternative to serological DR typing in clinical pr