1一株原油降解假单胞菌的筛选、鉴定及性能研究.doc

精品论文推荐1一株原油降解假单胞菌的筛选、鉴定及性能研究郝东辉，宋建蓉，王自豪，朱光宇，林建群，林建强*，曲音波山东大学微生物技术国家重点实验室，济南（250100）e-mail：摘要：从来自油田的样品中分离筛选到一株能在兼性厌氧条件下以石油为唯一碳源生长的 细菌 ss-18。通过菌体形态、生理生化特征以及 16srdna 序列分析，鉴定该菌为铜绿假单 胞菌。该菌可产生糖脂类生物表面活性物质，显著降低发酵液表面张力，促进原油乳化，具有较好的降油性能（13%左右）和显著的原油降粘能力（36%左右）。2%盐度对其降油和降粘有明显促进作用，降油率和降粘率最高，分别达到 17.4%和 39.5%。无机氮源尿素有利于 对原油的降粘作用。该菌在微生物采油和原油污染生物修复方面有较好的应用潜力。 关键词：微生物采油，铜绿假单胞菌，原油降解，原油降粘中图分类号：q939.971. 引言当前世界范围内原油贮量的日益减少带来了严重的能源危机。以目前的开采手段，原油 开采率一般只能达到 3050%，仍有大量石油尤其是高粘原油滞留在储油层1，2，3。因此， 提高原油采收率，充分利用现有油矿资源, 意义重大。原油采收率低的主要的影响因素之一 是由于常规开采之后，高粘原油比例增加造成原油流动性降低1。微生物提高石油采收率(microbial enhanced oil recovery technology 简称 meor)是近年 来研究和应用日趋成熟的一项技术，它可以较大幅度降低原油粘度，提高原油开采率，是目 前公认的开采油藏中剩余油和枯竭油藏最好的廉价的采油方法4。meor 主要通过两种机制 来降低原油粘度。一是利用微生物具有降解石油烃的能力，将长链直链烷烃通过末端氧化作 用相继氧化成相应的醇、醛和脂肪酸，脂肪酸再经 -氧化作用进一步被分解利用5。这一方 面降低了油中长链烷烃的比例，同时其中间代谢的各种脂肪酸类物质也可使原油中流动性成 分增加。二是利用微生物的代谢产物如生物表面活性剂来改变岩石表面的憎水性质，降低表 面张力和油水界面张力，促进原油乳化，从而降低原油粘度，提高原油采收率1，6。本文分离到一株在能在兼性厌氧条件下生存，产生表面活性物质，降解原油并降低原油 粘度的细菌，对其性能进行了研究。2材料与方法2.1样品及培养基菌株分离样品来源于大庆油田采出液及原油污染物。无机盐溶液（g / l）：k2hpo4 5.0，(nh4)2so4 1.0，mgso4 0.25，nano3 2.0，nacl 5.0，k2hpo43h2o 1.0，ph 7.07.2。葡萄糖培养基（种子培养基）：无机盐溶液中添加酵母膏0.05 %，葡萄糖 2 %，ph 7.0-7.2。lb 培养基（g / l）：胰蛋白胨 10、nacl 10、酵母粉 5，ph7.0-7.2。原油培养基：无机盐溶液中添加原油 2 %、0.1%或 60%（w/v）的原油，ph 7.0-7.5。 原油来自于大庆油田(c15c28, 粘度为 128 mpa.s)。1 本课题得到教育部高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20040422062）资助。- 8 -2.2 菌种分离厌氧培养瓶中加入含0.05%l-半胱氨酸以及0.01%刃天青氧指示剂的葡萄糖培养基并灭 菌。使用前厌氧瓶加热煮沸2025 min，充高纯无菌氮气驱除溶解氧，然后接入经无菌水 适当稀释的样品，40 ，200 r/min摇床培养7 d。富集的菌液以一定稀释度涂布于原油固体 平板上，40 好氧培养57 d。挑取较大降油斑在lb平板上反复划线分离单菌落。初筛得 到的纯培养物接入原油液体培养基中，以不接种的培养基为对照，40，120 r/min培养57d，进行复筛。2.3 菌种鉴定对新鲜的供试菌株菌落形态和个体形态进行观察，并进行一系列生理生化特征分析 7。 另外提取供试菌株染色体，采用通用引物（正向引物：5-agagtttgatcctggctcag-3； 反向引物：5-aaggaggtg atccagcc- gca-3）对供试菌株基因组进行16sr dna扩增。 pcr反应体系(100 l)：模板（约30 ng/l）2 l，dntp（各2.5 mm）8 l，缓冲液 10 l，正反向引物（20 m）各4 l，taq dna聚合酶3 u，重蒸水 71.4 l，pcr反应条件：94 1 min；55 1 min；72 2 min，30 个循环。pcr产物经纯化后测序并与genbank中的相关属种进行比对。2.4菌株性能研究菌悬液的制备：将供试菌株单菌落无菌操作接入葡萄糖培养基，37、200 r/min 摇床 培养至指数生长期，离心收集菌体用无机盐溶液清洗并重悬至菌悬液浓度约为 108 cfu /ml。 生长曲线的测定：将种子液接至葡萄糖培养基或原油培养基(100ml/300ml 培养瓶，原油 培养基中原油为 2%)中摇床培养，每隔一定时间取样离心，菌体用无菌水重悬，以无菌水为对照，应用 unico2000 分光光度计(unico 仪器有限公司，上海)测 od600 处光吸收值并作生 长曲线。对于耐盐实验则采用平板计数法计算活菌数（cfu /ml）并作生长曲线。表面张力测定：发酵液过滤除油、离心去菌体，用 jzhy1180 界面张力仪（承德市试 验机厂，中国）测定。ph 用 818 型 ph 计（奥立龙公司，美国）测定。糖脂定性分析：采用薄层层析法，发酵液过滤除油并离心去菌体，取 2 l 上清液与体 积比为 2 ：1 的氯仿 / 甲醇等体积混合，静止 5 min 后 6000 r/min 离心 10 min，取上层液体 进行薄层层析。展开剂氯仿:甲醇:水体积比为 65:15:2；显色剂为苯酚硫酸试剂，100 烘 烤 510 min 显色8。原油降解：将种子液接至原油降解培养基(50 ml/150 ml培养瓶，原油0.1%)中40摇床 培养7 d，将培养液倒入分液漏斗中，加入5 ml h2so4及20 g nacl摇匀，用30 ml正己烷萃 取。取1 ml萃取液注入25 ml容量瓶里，加正己烷定容。以正己烷为参比测定256 nm处吸 光度，并根据事先准备的标准曲线计算原油降解率9。原油降粘：将种子液接至原油降粘培养基(100ml/300ml 培养瓶，原油 60%)中 40摇床 培养 7 d，将培养液低速离心分离油水混合物，吸取上层原油，在 50 时使用 brookfield lv 型粘度计(brookfield engineering labratories. inc，u.s.a.) 测粘度，并以不接菌的培养基为对 照计算降粘率9。各实验接种量均为 2%，摇床转速为 150rpm。所有实验均做三个平行。3. 结果与讨论3. 1 兼性厌氧 meor 菌株的分离纯化按照2.2所述方法经初筛和复筛共得到23株纯培养物。各菌在以原油为唯一碳源的固体 培养基上划线培养时，降油菌株在石油膜上形成暗黄色的降油斑，通过降油斑大小、明显 程度的不同，以及摇瓶复筛时观察它们对原油的分散和乳化能力，筛选得到对原油降解、 乳化效果最为显著的一株细菌，命名为ss-18。ss-18菌株在以原油为唯一碳源的固体平板 上生长时，使油膜变得湿润，2 d左右即表现明显的降油斑（图1-a）；在以原油为唯一碳 源的液体培养基中培养35 d后，原油被乳化分散成细小的液滴，晃动时不挂壁（图1-b）。 倒出后观察其粘附能力显著降低，易被水冲洗下来。对照ss-18ab图 1 ss-18 在原油平板和原油液体培养基中生长照片a，原油平板划线培养物 b，原油液体培养基培养物。3.2菌种鉴定菌株ss-18在lb固体平板培养24 h，菌落呈圆形，边缘光滑，菌落微凸，表面粘稠，乳 黄色，长时间培养产水溶性绿色色素。油镜下观察细胞短杆状。生理生化实验结果显示， ss-18为革兰氏阴性细菌，半固体穿刺运动，能氧化葡萄糖产酸，过氧化氢酶和细胞色素氧 化酶反应阳性；甲基红、乙酰甲基甲醇实验反应阴性；能还原硝酸盐；不产生吲哚；能够 利用葡萄糖、乳糖和果糖；能产生脓青素。对其16s rdna进行扩增得到1450bp的产物，序 列分析显示其与genbank中多个铜绿假单胞菌的相似性达99100 %。根据上述实验结果， 最终鉴定ss-18为铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）。3.3 菌株生长及基本性能的研究为了确定 p.aeruginosa ss-18 在种子培养基和石油培养基中的生长情况，对该菌在这两 种培养基中的生长曲线进行测定。结果表明 p.aeruginosa ss-18 在以葡萄糖为唯一碳源时生 长良好，未出现明显的延迟期，在 10 h 内即可达到最大生长量（图 2-a）；而以石油为一唯 一碳源时，其生长比在葡萄糖培养基中稍弱且慢，在 3 d 后达到对数生长期（图 2-b）。对 其最适生长温度的研究表明，其最适生长温度为 3540，在大于 45时其生长受到抑制。 因此对于 p.aeruginosa ss-18 来说，在地面扩大培养阶段可以选用 35作为发酵温度，以减 少能耗；而对于地下采油应用，适合油层温度为 45左右的低温油田（数据未显示）。对 其最适 ph 值的研究表明在 ph5.57.5 范围内对其生长影响不大（数据未显示）。p.aeruginosa ss-18 在葡萄糖培养基和原油培养基中生长时还可显著降低发酵液的表面张力，由最初的 74 mn/m 降至 41 mn/m 左右。对其发酵液进行薄层层析显示其产生糖脂类表面活性物质，并且只出现两个棕黄色糖脂显色点（图 3），这与文献报道的铜绿假单胞菌 产鼠李糖脂的层析结果一致 10。铜绿假单胞菌一般只产生一种糖脂类生物表面活性剂 鼠李糖脂，能急剧降低表面张力；分散原油使烃类乳化；改变岩石的憎水性质，从岩石表面 洗掉油膜；是目前采油工业中研究和应用较多的一种表面活性剂2,11,12,13。此外，该菌在原 油培养基中培养后 ph 降低不明显，说明几乎没有产酸（数据未显示）。对 p.aeruginosa ss-18 原油降解和降粘情况进行测定，结果表明在原油培养基中生长 7d， 降油率为 13左右，降粘率可达 36%左右，具有良好的降油、降粘性能。od600 nm0.20.00 2 4 6 8 10121416time(h)图 2-a p.aeruginosa ss-18 在葡萄糖培养基中的生长1.00.8od600 nm0.00246810time(d)图 2-b p.aeruginosa ss-18 在原油培养基中的生长曲线图 3 p.aeruginosa ss-18 糖脂薄层层析图3.4 盐度对 p.aeruginosa ss-18 生长和降油降粘性能的影响地下油藏和油田区域的水域和土壤常常具有较高的矿化度，这种高的盐度对采油微生物 在油层中的生长对原油的利用有明显的抑制作用14。因此对盐度对 p.aeruginosa ss-18 生长 和降油、降粘性能的影响进行了研究。在葡萄糖和原油培养基中分别添加 nacl 至终浓度为 0%、2%、5%、10%，接入种子悬 液培养并定时取样，测定不同盐度下 p.aeruginosa ss-18 在葡萄糖和原油培养基中的生长。 结果表明，在以葡萄糖为唯一碳源时，p.aeruginosa ss-18 的发酵周期为 14 h 左右，2%盐度 对其生长有一定的促进作用，8.5 h 左右即可达到最高菌浓（od600 值为 1.912）并可长时间 维持菌浓；在 5%盐度以上时 p.aeruginosa ss-18 仅能维持缓慢生长，菌浓显著降低（数据 未显示）。这一结果显示在地面扩大培养菌体时，可少量添加 nacl 以促进其生长。在以石 油为唯一碳源时，2%盐度最适于该菌生长，第 6 d 可达最高菌浓（2.4109 cfu /ml）；而在5%盐度下 p.aeruginosa ss-18 仍可利用石油为唯一碳源缓慢生长，第 6 d 可达到最高菌浓（1.7108 cfu /ml）；在 10%盐度下第 6 d 仍可检测到一定量的活菌（3.8106cfu /ml）。这表 明 p.aeruginosa ss-18 对高盐环境具有一定的耐受性。为了确定盐度对 p.aeruginosa ss-18 降油降粘性能的影响，在降油和降粘培养基中分别 添加 nacl 至终浓度为 0%、2%、5%、10%，接入种子液培养 7 d，测定不同盐度下微 p.aeruginosa ss-18 对原油的降解率和降粘率，结果见图 5。p.aeruginosa ss-18 对原油的作 用效果与其在原油中的生长呈明显相关性。在较低盐度下 p.aeruginosa ss-18 可以利用原油 为唯一碳源生长，并有较高的降油和降粘率。在 2%盐度下生长状况最好，降油率和降粘率 也均最高，分别达到 17.4%和 39.5%；在 5%盐度以下也可生长并有一定降油率，但远低于2%盐度时的降油率；而在 10% 盐度时，因其生长被较强程度的抑制，故其对原油的作用也 极其微弱。上述实验结果表明过高的盐度对 p.aeruginosa ss-18 的原油降解和降粘作用影响较大， 一般海水和地下水的盐度为 2.53.5%5,15，因此该菌可以满足这种中低盐度地域的 meor 作业。300%2%25 5%10%201510density of cell (108 cfu/ml)500 2 4 6 8time(d)图 4 不同盐度下 p.aeruginosa ss-18 在石油培养基中的生长曲线45 crude oil degradationcrude oil viscosity reduction40the percent of reduction (%)353025201510500% 2% 5%10%the concentration of nacl图 5 不同盐度对 p.aeruginosa ss-18 降油和降粘的影响3.5无机氮源对 p.aeruginosa ss-18 降油和降粘的影响meor 应用过程中地下微生物的碳源可以来自原油，而氮源则有可能缺乏，需要随注 入水一同注入地下。考虑到成本和避免对地下环境的污染，最好使用无机氮源。因此对几种 常见无机氮源对 p.aeruginosa ss-18 降油、降粘作用的影响进行了研究。在去掉氮源组分的无机盐溶液中分别添加 0.2%的无机氮源：尿素、nh4cl、nh4no3、（nh4）2so4，以原油为唯一碳源，并以无机盐溶液培养基为对照，对其利用这些氮源时的降油降粘性能进行测定。结果表明（图 6），对于原油降解来说，使用上述几种无机氮源的效果均不如应用无机盐溶液的效果。对于降粘作用，尿素和 nh4cl 优于无机盐溶液。其中 添加尿素时可达到最高的降粘率 38.3%。crude oil degradationcrude oil viscosity reduction4035the percent of reduction(%)302520151050ureanh4clnh4no3(nh4)2so4bmsmnitrogen source图 6 不同无机氮源对 p.aeruginosa ss-18 降油降粘作用的影响bmsm， 无机盐溶液4. 结论本研究从大庆油田的样品中经过大量的筛选，得到一株以石油为唯一碳源生长的兼性厌 氧细菌菌株 pseudomonas aeruginosa ss-18。该菌可在 3540，ph5.57.5 范围内正常生 长，并产生糖脂类生物表面活性物质，显著降低发酵液表面张力，促进原油乳化。它具有较好降油性能（13%左右）和显著的降粘能力（36%左右）。2%盐度对其生长和降油、降粘作 用有明显促进作用，降粘率和降油率都达到最高值，分别达到 39.5%和 17.4%。此外，尿素 做为良好的无机氮源，可加强原油的降粘作用。但所试的几种无机氮源对原油降解作用均无 太大改善。以上实验结果表明，p. aeruginosa ss-18 在多数中低温和中等盐度油田的 meor 中有较好的应用前景。此外 p. aeruginosa ss-18 良好的降油、降粘性能，在石油污染的生物 修复方面也具有一定的应用潜力。参考文献1 banat,i.m. . biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review j . bioresource technol, 1995, 51: 1-12.2 刘波, 张红梅, 鼠李糖脂应用于三次采油的实验研究 j . 油气采收率技术, 1997, 4 (3):20-25.3 fiechter, a. biosurfactants: moving towards industrial application j . trends in biotechnol, 1992, 10:208-217.4 bock, m., bosecker, k. occurrence of biosurfactant-producing bacteria in oil reservoirs, contaminated soils, and surface waters in northern gemany j . geol. jahrbuch, 1997, 5(103): 147-157.5 venosa, a.d., zhu, x.q. biodegradation of crude oil contaminating marine shorelines and freshwater wetlands j . science & technology bulletin , 2003, 8(2):163-178.6 包木太, 牟伯中, 王修林等. 微生物石油采收率技术 j . 应用基础与工程科学学报, 2000, 8(3): 236-245.7 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册 m . 北京:科学出版社, 2001.8 薛燕芬，王修垣. 用两步法展开薄层层析定性鉴定糖脂 j . 微生物学报，1989，29(1): 75-77.9 宋茂勇,林建强,魏玉华等.芽孢杆菌s-1 提高石油采收率研究 j . 山东大学学报(理学版), 2004, 39(1):117-120.10 koch a k, kppeli o, fiechter a, et al. hydrocarbon assimilation and biosurfactant production inpseudomonas aeruginosa mutants j . j. bacteriol, 1991, 173(13): 4212-4219.11 zhang, y.m, miller, r.m. enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a pseudomonasrhamnolipid surfactant (biosurfactant) j . appl. environ. microbiol. , 1992, 10: 3276-3282.12 zhang, y.m, miller, r.m. effect of a pseudomonas rhamnolipid biosurfactant on cell hydrophobicity and biodegradation of octadecane j . appl. environ. microbiol. , 1994 ,6: 2101-2106.13 李华斌, 杨振宇, 杨林等. 大庆油田鼠李糖脂生物表面活性剂提高采收率 j , 西南石油学院学报,2001, 23(1):25-28.14 rhykerd, r. l., weaver, r. w., mclnnes, k. j. influence of salinity on bioremendiation of oil in soil j .environmental pollution , 1995, 90(1): 127-130.15 mukherji, s., jagadevan, s., mohapatra, g. et al. biodegradation of diesel oil by an arabian sea sediment culture isolated from the vicinity of an oil field j . bioresource technolohy, 2004, 95: 281286.isolation, identification and performance studies of aoil-degrading pseudomonas aeruginosa strainhao donghui，song jianrong，wang zihao，zhu guangyu，lin jianqun，linjianqiang*，qu yinbostate key lab of microbial technology，shandong university，jinan （250100）abstracta facultatively anaerobic bacteria strain ss-18, that was able to use crud