两种转染试剂转染C2C12细胞效率比较分.doc

精品论文两种转染试剂转染 c2c12 细胞效率比较分析韦伟，赵元元，张维娅，赵书红，李新云5（农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，华中农业大学，武汉 430070） 摘要：c2c12 细胞是鼠的骨骼肌成肌细胞，常用于体外研究肌细胞成肌分化，研究表明 c2c12 细胞的转染效率较低，为了提高 c2c12 细胞的转染效率，建立理想的转染条件，本研究对 比分析了 fugene hd 和 lipofectamine 2000 两种常用转染试剂的转染效率。研究结果表明10fugene hd 转 染 寡核 苷酸 的效率比 lipofectamine 2000 高， 而转染 质粒 的效率 比lipofectamine 2000 低。另外我们还发现培养基中的血清会降低细胞的转染效率。本研究结 果为提高 c2c12 细胞的转染效率提供了新的信息。关键词：转染效率；寡核苷酸；质粒；c2c12 细胞中图分类号：q-3315compare analysis of the transfection efficiency of two transfection regents in c2c12 cellswei wei, zhao yuanyuan, zhang weiya, zhao shuhong, li xinyun(key lab of agricultural animal genetics, breeding and reproduction of ministry of education,20huazhong agricultural university, wuhan 430070)abstract: c2c12 cells are the myoblast of mice, which are used as the model for investigating the differentiation of myoblast in vitro. the transfection efficiency of the c2c12 cells was not good inmany studies. in order to improve the transfection efficiency of c2c12 cells and contribute anideal condition of transfection. the transfection efficiency of two transfection reagents, fugene25hd and lipofectamine 2000, was analyzed in this study. according the results, the transfection efficiency of fugene hd was higher than that of lipofectamine 2000 when oligo nucleic acids was transfected, but it was lower than lipofectamine 2000 when plasmid wastransfected in the c2c12 cells. also, we found that serum in cultured medium could inhibit the transfection efficiency. these results offered useful information for improving the transfection efficiency of30c2c12 cells.key words: transfection efficiency; oligo nucleic acids; plasmid; c2c12 cells0引言简转染是指将外源遗传物质转入到真核细胞内的过程。转染对现代分子生物学研究意义35重大，它解决了外源遗传物质导入细胞的难题，为在细胞水平上进行基因功能研究奠定了基 础。转染技术多种多样，按外源遗传物质是否与基因组整合来分，转染技术分为瞬时转染和 稳定转染两大类。按转染实施手段来分，转染技术分为物理转染法和化学转染法两大类。常见的物理转染方法有显微注射、电穿孔、基因枪、光学转染等；化学转染法包括 deae-葡 聚糖法、磷酸钙法、人工脂质体法等。转染技术的选择会影响细胞转染效率，进而影响到实40验结果。因此在进行细胞转染前，应该对转染过程中涉及的因素进行综合分析，以便筛选出 针对特定细胞转染的最适方法和条件。阳离子脂质体因其转染效率高、安全（可降解）、操作简便等原因而倍受关注(1,2)，现广泛用于人和其他哺乳动物细胞系或体内细胞的瞬时转染基金项目：本研究受教育部新教师基金项目(20090146120032)；国家自然科学基金资助项目(30901020)以及973 项目（2012cb124702）资助。作者简介：韦伟（1986-），女，博士在读，主要研究方向：骨骼肌生长发育分子机理通信联系人：李新云（1976-），男，副教授，主要研究方向：骨骼肌生长发育分子机理. e-mail:- 5 -(3-7)。目前已有许多研究针对阳离子脂质体的转染效率进行了条件优化，比如 dna 用量、 脂质体和 dna 的体积质量比、细胞汇合度、脂质体浓度、转染时间等(8-10)。45本研究主要对实验室常用的 fugene hd 和 lipofectamine 2000 两种脂质体转染试剂的转染效率进行了对比分析。我们选取了比较难于转染的鼠 c2c12 成肌细胞，对比分析了这 两种转染试剂在 c2c12 细胞中转染寡核苷酸以及质粒的效果。同时，我们还研究了血清对 c2c12 细胞转染效率的影响。本研究发现 fugene hd 转染寡核苷酸的效率比 lipofectamine2000 高，而转染质粒的效率比 lipofectamine 2000 低。另外，血清会降低 c2c12 细胞的转50染效率。1实验1.1材料dmem 高糖、胰酶、胎牛血清（hyclone 公司）；opti-mem i reduced serum medium（gibco 公司）；转染试剂 lipofectamine 2000（invitrogen 公司）；fugene hd transfection55reagen（troche 公司）；fam 标记的 small rna 模拟物 fam-nc（上海吉玛公司）；pegfp-c1及 c2c12 细胞由实验室保存；六孔细胞培养板（corning 公司）。1.2主要仪器co2 细胞培养箱为 thermo scientific 公司产品，倒置荧光显微镜为 nicon 公司产品。1.3方法601.3.1用 lipofectamine 2000 和 fugene hd transfection reagent 向 c2c12 细胞中转染fam-nc 寡核苷酸转染前一天，将 c2c12 细胞接种到六孔细胞培养板，待细胞汇合度达 6070%时进行转 染。转染之前将细胞分成两组：lipofectamine 2000 组和 fugene hd 组，分别将两组中细 胞的培养基换为不含胎牛血清的 dmem 培养基。转染时用 opti-mem i reduced serum65medium 稀释 lipofectamine 2000、fugene hd 以及 fam-nc。稀释后，将 fam-nc 分别 与 lipofectamine 2000、fugene hd 混合孵育，使之形成转染复合物。然后将这两种转染复 合物分别加入两组细胞中，转染 6h 后换液。转染 24h 后弃上清，用 pbs 清洗一次，用倒置 荧光显微镜观察两组细胞的荧光数目和强度。1.3.2用 lipofectamine 2000 和 fugene hd transfection reagent 向 c2c12 细胞转染70pegfp-c1 载体转染前一天， 将 c2c12 细胞接种到六孔细胞培养板，待细胞汇合度达 6070%时进行 细胞转染。转染前细胞分组及换液同上。转染时用 opti-mem i reduced serum medium 稀释 lipofectamine 2000、fugene hd 以及 pegfp-c1 质粒。将 pegfp-c1 质粒分别与两种转染 试剂混合，形成转染复合物。将转染复合物加入到细胞中进行转染，转染效果检查同上。751.3.3用 lipofectamine 2000 向带有血清和无血清的 c2c12 细胞中转染 fam-nc 寡核苷 酸转染前一天， 将 c2c12 细胞接种到六孔细胞培养板，待细胞汇合度达 6070%时进行 细胞转染。在转染之前将细胞分成两组：血清组和无血清组。分别将两组细胞的培养基换为 含 10%胎牛血清的 dmem 培养基（血清组）和不含胎牛血清的 dmem 培养基（无血清组）。80转染时用 opti-mem i reduced serum medium 稀释 lipofectamine 2000 和 fam-nc，然后混合形成转染复合物。将完全相同的转染复合物分别加入两组细胞进行转染。转染后 6h 统一 换成含有 10%胎牛血清的 dmem 培养基培养。转染后 24h 检测转染效果，方法同上。2结果2.1c2c12 细胞中 fugene hd 转染寡核苷酸的效率比 lipofectamine 2000 高85分别用 fugene hd 和 lipofectamine 2000 向 c2c12 细胞转染 fam-nc 寡核苷酸， 转 染 24h 后用荧光倒置显微镜观察两组转染试剂的转染效果。结果如图 1 所示 fugene hd 转 染试剂组的荧光强度明显高于 lipofectamine 2000 组，这表明在 c2c12 细胞中转染寡核苷酸， 用 fugene hd 比用 lipofectamine 2000 要好。90（a）（b）图 1 c2c12 细胞转染 fam-nc 24h 后的荧光显微照片。（a）fugene hd 转染 fam-nc 的结果；（b）lipofectamine 2000 转染 fam-nc 的结果。fig. 1 the fluorescence microscopy photos of c2c12 cells when fam-nc was transfected for 24 hours. (a) fam-nc was transfected into c2c12 cells using fugene hd; (b) fam-nc was transfected into c2c12 cells95using lipofectamine 2000.1001052.2c2c12 细胞中 lipofectamine 2000 转染质粒的效率比 fugene hd 高分别用 fugene hd 和 lipofectamine 2000 向 c2c12 细胞转染 pegfp-c1 质粒， 转染24h 后用荧光倒置显微镜观察两组转染试剂的转染效率。结果如图 2 所示 lipofectamine 2000 转染试剂组的荧光强度明显高于 fugene hd 组，这表明在 c2c12 细胞中转染质粒，用 lipofectamine 2000 比用 fugene hd 要好。（a）（b）图 2 c2c12 细胞转染 pegfp-c1 质粒 24h 后荧光显微照片。（a）lipofectamine 2000 转染 pegfp-c1 质粒 的结果；（b）fugene hd 转染 pegfp-c1 质粒的结果。fig. 2 the fluorescence microscopy photos of c2c12 cells when pegfp-c1 was transfected for 24 hours. (a)pegfp-c1 was transfected into c2c12 cells using lipofectamine 2000; (b) pegfp-c1 was transfected intoc2c12 cells using fugene hd.1101151201252.3血清降低 lipofectamine 2000 转染 pegfp-c1 质粒的效率用 lipofectamine 2000 向 c2c12 细胞中转染 pegfp-c1 质粒，转染前细胞随机分成两 组，分别换液，血清组换含有 10%的胎牛血清的培养基，无血清组换不含血清的培养基。 转染试剂及 pegfp-c1 质粒稀释、混合同上。转染 24h 后用荧光倒置显微镜观察血清组和无 血清组中荧光细胞数目和荧光强度。结果如图 3 所示，无血清组的荧光细胞数目及强度显 著高于血清组。这表明血清会降低 lipofectamine 2000 转染质粒的效率。（a）（b）图 1 用 lipofectamine 2000 向 c2c12 细胞转染 pegfp-c1 质粒的荧光显微照片。（a）lipofectamine 2000 在无血清培养基中转染 pegfp-c1 质粒的结果；（b）lipofectamine 2000 在血清培养基中转染 pegfp-c1 质粒的结果。fig. 1 the fluorescence microscopy photos of c2c12 cells when pegfp-c1 was transfected for 24 hours usinglipofectamine 2000. (a) c2c12 cells were transfected with pegfp-c1 using lipofectamine 2000 in the serum-free medium; (b) c2c12 cells were transfected with pegfp-c1 using lipofectamine 2000 in the serum containing medium1301353讨论阳离子脂质体由于转染效率高、安全、操作简便等原因广泛用于细胞的瞬时转染操作。 对转染过程中的各个因素进行条件优化，提高脂质体转染效率是众多研究的主要内容之一。 本研究主要对实验室常用的两种脂质体转染试剂进行了转染效率比较，我们选取了转染效率 较低的鼠 c2c12 成肌细胞为转染对象，分别进行了进行寡核苷酸以及质粒的转染实验。研 究结果表明，在转染寡核苷酸时，fugene hd 的优势是非常明显的；然而在转染质粒 pegfp-c1 时，其转染效率不及 lipofectamine 2000。核酸的大小、空间结构以及转染试剂具 体作用机制的差异都有可能是造成这种现象的原因。根据我们的结果，我们认为在 c2c12 细胞中转染质粒时最好用 lipofectamine 2000，而转染寡核苷酸最好选用 fugene hd。另外，我们研究还发现在脂质体类试剂转染 c2c12 细胞的过程中，血清会降低转染效 率，其主要原因可能是血清影响了脂质体-核酸复合物与细胞膜的融合，也有可能是血清破坏了脂质体-核酸复合物的状态，总之血清对转染效率有一定的负作用，建议在细胞转染时最好不加血清。1401451501551604结论在对 c2c12 细胞进行寡核苷酸转染时，fugene hd 比 lipofectamine 的效率高；而在 对 c2c12 细胞进行质粒转染时，lipofectamine 比 fugene hd 转染效率高。细胞转染时培 养基中的血清会降低脂质体的转染效率。参考文献 (references)1 ropert. liposomes as a gene delivery systemj. braz j med biol res, 1999, 32(2): 163-169.2 gao and huang. cationic liposome-mediated gene transferj. gene ther, 1995, 2(10): 710-722.3 baccaglini, shamsul hoque, wellner, et al. cationic liposome-mediated gene transfer to rat salivary epithelial cells in vitro and in vivoj. j gene med, 2001, 3(1): 82-90.4 kojima, ohishi, takamori, et al. cationic multilamellar liposome-mediated gene transfer into primary myoblastsj. biochem biophys res commu